[发明专利]一种鉴定赖氨酸ε‑氨基侧链单甲基化修饰的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测诊断领域，特别地，属于一种鉴定及定量细胞或组织中赖氨酸单甲基化修饰底物的方法；更特别的，属于利用特异性抗体的亲和富集与质谱分析的蛋白组学方法鉴定及定量细胞或组织中赖氨酸单甲基化修饰底物。

背景技术

蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基侧链可以发生单、双或三甲基化修饰。在过去的几十年里，对赖氨酸甲基化修饰(Kme)的生物学研究主要集中在核心组蛋白。前期的研究证明了这种修饰在染色体结构和功能行使中的关键作用。这种修饰状态被2组具有相反催化功能的酶所调节，即赖氨酸甲基化转移酶和赖氨酸去甲基化酶。目前有超过50个赖氨酸甲基化转移酶和约25赖氨酸去甲基化酶被发现。组蛋白来氨酸甲基化修饰与各种疾病相关，例如癌症。相应的，赖氨酸甲基化调节酶成为一系列潜在的药物靶点。

当今在组蛋白中所发现的蛋白质翻译后修饰类型(PTMs)在非组蛋白中都存在。在鉴定到的赖氨酸甲基化调节酶中，存在一些非细胞核定位的酶和新发现的不以组蛋白为底物的赖氨酸甲基化调节酶，说明赖氨酸甲基化应该在非组蛋白中广泛分布。鉴定蛋白质底物是确定蛋白质翻译后修饰功能的前提，赖氨酸甲基化生物学的研究历史将该前提的重要性阐述的非常清楚。整合我们和他人的数据后发现，赖氨酸乙酰化底物出现在染色体结构、转录调节和如新陈代谢三个研究领域中，而且相互之间具有底物的重叠性。尽管赖氨酸乙酰化修饰的底物鉴定较迟，关于它的研究表明赖氨酸乙酰化在上述三个研究领域中是协同作用。类似地，赖氨酸甲基化修饰组的鉴定和定量比较发现了一些下游的与染色体无关的非组蛋白及信号通路，这为后续的功能研究打下坚实的基础。

虽然如此，鉴定赖氨酸甲基化底物并不简单。与鉴定磷酸化修饰用引入³²P标记不同，³H或¹⁴C的低放射性使放射性同位素检测方法在赖氨酸甲基化底物鉴定上难以实施。甲基化，尤其是单甲基化(Kme1)，只在其底物中引入了一个很小的结构基团，因而被修饰的赖氨酸基团与未发生修饰的赖氨酸基团差别细微，只有一个极小的构象用来开发亲和性抗体。若要同时兼顾亲和性和特异性，开发与序列无关的甲基化抗体(泛抗体)是一个巨大挑战。其结果是， 由于没有合适的甲基化肽段富集方法为后续质谱分析提供肽段，赖氨酸甲基化底物的鉴定进程缓慢。正如磷酸化和赖氨酸乙酰化组学研究中描述，亲和富集是研究蛋白质翻译后修饰(PTM)整体分析的关键步骤(Kim,S.C.et al.Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey.Mol Cell23,607-618(2006))。由于单甲基化修饰的赖氨酸和未修饰的赖氨酸的物化性质差异很小，因此采用如分离磷酸化多肽的固定化金属亲和层析(IMAC)等化学方法来分离甲基化修饰的赖氨酸多肽很困难(Ficarro,S.B.et al.Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae.Nature biotechnology20,301-305(2002))。另外，制备高特异性和高亲和性的抗赖氨酸单甲基化的抗体也很困难。因此，需要对现有的基于蛋白质组学技术进行创新才能对赖氨酸甲基化修饰进行鉴定和分析。特别地，需要对赖氨酸单甲基化修饰的底物鉴定与定量分析方法进行全新的发明创造。

发明内容

为解决这个技术困难，本发明开发了一个新的化学蛋白质组学方法。利用该方法可以高效、准确的鉴定肽段中是否发生赖氨酸ε-胺基单甲基化修饰以及修饰的位点，定量分析修饰的变化水平。

一方面，本发明提供一种鉴定底物肽段或蛋白中是否在赖氨酸的ε-胺基上发生单甲基化修饰的方法，方法包括：采用体外氮酰化衍生化反应，让所述的底物上的单甲基化ε-胺基的赖氨酸残基衍生为酰甲基化ε-胺基；用抗酰甲基化的泛抗体亲和富集发生酰甲基化修饰的肽段；用液质联用质谱仪鉴定抗体亲和富集的多肽是否发生了丙酰甲基化修饰。

优选的，根据液质联用质谱仪检测获得的结果，并由此判断或推定底物蛋白或肽段上是否实际存在的赖氨酸单甲化修饰。