[发明专利]一种Δ6-脂肪酸脱氢酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及从一种丝状真菌---毛霉属的深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中克隆的Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因，并将该基因直接与不同载体连接，转入细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ⁶-脂肪酸脱氢酶产生包括γ-亚麻酸等多不饱和脂肪酸。

背景技术

γ-亚麻酸（γ-linolenic acid）是一种多功能油脂成分，是人体必需的多不饱和脂肪酸，具有多种重要的生理活性作用，在机体的生理调控和物质代谢上发挥着重要的作用，如降血脂、抗血栓性心脑血管、预防和治疗高血压、动脉粥样硬化，增强人体的免疫功能，还具有抗肿瘤、抗脂质过氧化、抑制溃疡和增强胰岛素和减肥等方面的作用[董杰明等，2003，卫生研究,32(3):299-301]。尤其是在糖尿病、心血管疾病及癌症方面的医疗价值，γ-亚麻酸已成为学术界研究的热点。

Δ⁶-脂肪酸脱氢酶能特异性催化亚油酸(linoleic acid, C18:2Δ^9,12)和α-亚麻酸 (α-linolenic acid, C18:3Δ^9,12,15) 羧基端的第6和第7位碳原子之间插入一个新的双键，分别脱氢形成 γ-亚麻酸 （γ-linolenic acid, C18:3Δ^6,9,12）和十八碳四烯酸 (stearidonic acid, C18:4Δ^6,9,12,15)，它们再通过碳链延伸和脱氢进一步形成其它长链的多不饱和脂肪酸（long-chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFAs），因此Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是人和哺乳动物体内合成长链多不饱和脂肪酸的关键酶。这些长链多不饱和脂肪酸是机体组织生物膜组成成分，起到维持细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用[Napier JA et al，1999，Curr.Opin.Plant Biol，2:123-127]，同时也是前列腺素、环前列腺素和白三烯类等具有强烈生理活性的自身调节物的前体[Horrobinn DF,1992,Prog Lipid Res.,31:163-194]。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶活性的降低将导致γ-亚麻酸的合成量减少，引起人体的各种机能紊乱，进而引发各种疾病。因此，从不同生物体中克隆Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因，再与不同表达载体连接后转入不同的宿主细胞进行表达，利用宿主产生γ-亚麻酸和其他长链多不饱和脂肪酸具有极大应用前景。

由于人们越来越认识到γ-亚麻酸和其他长链多不饱和脂肪酸的重要性，因此将注意力又转向对Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的研究上。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶属于一类膜整合酶，由于分离和鉴定膜结合蛋白的难度很大[MaKeon，1981，酶学方法，12141-12147；wang等，1988，植物生理学生物化学，26:777-792]，因此常规的生物化学方法很难得到包括Δ⁶-脂肪酸脱氢酶在内的各种膜结合蛋白性质脱氢酶高级机构，而只能通过对酶的核苷酸序列进行初步研究，对于Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的生物学功能验证，许多实验室采用了从各种生物体中克隆相关的基因并转入各种受体细胞中，然后在受体细胞中观察其脂肪酸改变的方法。序列对比的结果表明，编码Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列具有共同的机构特性：存在三个组氨酸保守区，形成四次跨膜的结构[Kyte et al，1982，J.Mol.Biol.157:105-132]，此外，除了蓝细菌外，真核生物的Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的氨基端都含有类似于细胞色素b5(Cytb5)血红素结合区（HPGG）[Napier JA,Sayanova O,Stobart AK,et al.,1997,Biochem.J.,157:105-132]，这些都是维持脱氢酶活性所必须的。