[发明专利]一个高产药用天然产物的硬紫草转LeMYB1基因毛状根株系

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及将携带编码转录因子基因的植物表达载体转入发根农杆菌，然后再侵染硬紫草无菌苗而诱导出高产药用天然产物的转基因毛状根株系。 

背景技术

紫草属紫草科多年生药用草本植物，主要包括新疆紫草(Arnebia euchroma (Royle)Johnst.)、内蒙紫草(Arnebia guttata Bunge.)、硬紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc)和滇紫草(Onosma paniculatum Bur.et Franch)等。其根系可产生紫草宁及其衍生物等药用天然产物活性成分，具有抗免疫缺血、抗肿瘤，治疗风湿性关节炎、多硬化症、艾滋病、过敏性紫癜、银屑病以及保肝护肝、降血糖、降血粘度、降压、解热、镇痛止痛等功效^[1-4]。另外，紫草的多糖成分能增强机体特异性和非特异性免疫能力；紫草油具有治疗烧伤、烫伤、急慢性脓耳、口腔溃疡、褥疮、痔疮、急慢性湿疹以及促进伤口愈合等功效^[5-7]。紫草色素的抗真菌作用还可作为生物毒素用于番茄叶霉病的防治^[8，9]。此外，紫草素还可作为天然色素，被联合国食品添加剂法典委员会列入食品、化妆品、药品添加剂范围，广泛用于化妆品、防晒制品(如塑料制品)、食品、药品等着色以及印染、洗涤剂的添加剂等，被国际誉为红色素之王^[10-12]。因此，紫草已逐渐成为医疗、食品色素和化妆品及防病治病开发新药研究的热点。 

随着现代生物技术的发展，采用细胞培养工程技术生产并提高人类所需的紫草宁及其衍生物，成为一种非常重要的生物技术手段。上世纪70年代，日本即已成功运用两阶段培养体系，即在光照条件下B5固体培养基上繁殖紫草细胞，然后在黑暗条件下利用M9液体生产培养基中培养紫草细胞进行工业化生产紫草宁 ^[13]。然而在植物细胞培养过程中普遍存在细胞系不稳定，细胞生长缓慢，不耐剪切及代谢物产量低等问题，成为其实现规模化生产的瓶颈。 

毛状根体系的建立可为大量生产天然活性物质提供有效的手段。发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)是属于根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，能侵染绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物，诱发被侵染植物受伤部位产生毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根特性是由于它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒，Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个大质粒，带有冠瘿碱合成基因和生长素合成基因。毛状根培养是较细胞培养产生天然产物更优越的实验材料^[14]。此外，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到寄主染色体、其诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛状根体系，提高毛状根中次生代谢物的产量，在定向植物分子育种方面具有广泛应用前景。近年来利用发根农杆菌已成功转化多种药用植物并建立了毛状根转基因体系，极大地方便了药用天然产物得生产及遗传育种研究。 

茉莉酸是一种能调控植物生长发育、抗逆境、创伤胁迫反应及植物次生代谢合成等多个生理过程的激素。茉莉酸类物质能诱导植物细胞生产更多的次生代谢产物，如茉莉酸可诱导植物产生尼古丁、芥子油苷、苜蓿碱、异类黄酮等生物碱和酚酸类次生代谢产物。紫草宁同样受到茉莉酸及其甲酯类衍生物的高效诱导合成^[15-17]。在茉莉酸类物质调节植物次生代谢产物合成中的过程中，转录因子起到相当重要的作用。 

在本实验室室前期研究外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导紫草宁合成的功能蛋白质组学过程中，我们发现了一个受到外源MeJA诱导表达的R2R3类MYB转录因子蛋白，结合其他植物中已有的对R2R3类MYB转录因子的研究结果^[18]，推测其很可能参与介导了MeJA促进紫草宁及衍生物合成的生物学过程。 

紫草的LeMYB1是本实验室克隆的一个编码R2R3类MYB转录因子蛋白基因 ^[19]。紫草细胞从B5转入M9中后，LeMYB1受诱导表达，且受到MeJA的高效调控；而且该基因在紫草根部(紫草宁合成的特异性部位)高表达，推测该基因参与茉莉酸介导的对紫草宁的合成调控^[19]。 

通过转基因技术将紫草本身的LeMYB1基因转入紫草中过表达，提高紫草毛状根中紫草宁的含量，从中筛选出高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系，在理论上是完全可行的。