[发明专利]一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的快速评估方法

权利要求书

1.一种豆科植物根瘤固氮共生体系固氮能力的快速评估方法，其特征在于，包括：

一：植物-根瘤菌转录本信息共提取：（1）设定对照组和待测组，对照组和待测组分别由一个或两个以上样本组成，分别提取各样本根瘤总RNA；（2）用分光光度计分别检测各样本中提取的总RNA，得到总RNA的浓度和质量；

二：固氮酶基因转录水平原位检测：（1）分别将对各样本的mRNA反转录成cDNA；（2）分别用实时荧光定量PCR方法扩增各样本的固氮酶nifH基因和参比基因16s，并用2^-ΔΔCt方法计算待测组相对于对照组，固氮酶nifH基因的相对转录丰度；

三：以固氮酶基因nifH的相对转录丰度来评估大豆根瘤固氮共生体的固氮能力。

2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述样本取自一株或两株以上相同品种豆科植物。

3.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：一：植物-根瘤菌转录本信息共提取：

(1)设定对照组及待测组，分别取对照组及待测组内各个样本的新鲜根瘤50-200mg ,在液氮中研磨成细粉状，立即加入RNA提取液1-2ml，继续研磨成匀浆；

将匀浆1-2ml转移到离心管中，加入200-400ul氯仿，混匀；

加入50-100ulRNase-free 双蒸水及50-200ul氯仿,混匀，离心5-20分钟，4℃，12,000×g-16,000×g；

将600ul-800μl上清液转移到RNase-free离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，离心5-20分钟， 12,000×g-16,000×g，弃上清；

加入1-2ml 70-80 %乙醇，混匀， 6000×g-8000×g离心4-7分钟，倒出液体，留沉淀；

加入30-100μl RNase-free双蒸水，混匀；

(2)分光光度计分别测定各样本的RNA浓度和质量，并用RNase-free 双蒸水将各样本稀释成同样浓度；

二：固氮酶基因转录水平原位检测：

(1)获得的RNA进行反转录，将mRNA逆转录成cDNA；

(2)采用实时荧光定量PCR，以cDNA为模板分别扩增个样本的固氮酶基因nifH和参比基因16s；

根据实时荧光定量PCR得到的Ct值，用2^-ΔΔCt方法计算分析待测组相对于对照组，固氮酶基因nifH的相对转录丰度；

三：以固氮酶基因nifH的相对转录丰度来评估大豆根瘤固氮共生体的固氮能力:

以nifH基因的相对转录丰度来评价固氮能力，当相对转录丰度为1时，表明待测组相对于对照组，固氮能力相同；当相对转录丰度低于1时，表明待测组相对于对照组，固氮能力低；当相对丰度大于1时，表明待测组相对于对照组，固氮能力高。

4.根据权利要求3所述的评估方法，其特征在于，步骤（1）中，取新鲜根瘤100mg，RNA提取液为Trizol-A+,加入量为1ml；步骤（1）中，将匀浆1ml转移到Phase Lock Gel^TM管，加入400μl氯仿，混匀。

5.根据权利要求3所述的评估方法，其特征在于，步骤（1）中，所述混匀后，将匀浆分别冰上放置5-20和3-7分钟，氯仿加入量分别为400μl和200μl。

6.根据权利要求3所述的评估方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心为4℃，12,000×g，离心15分钟。

7.根据权利要求3所述的评估方法，其特征在于，步骤（1）中75%乙醇加入量为1ml，所述离心为4℃，7500×g，离心5分钟。

8.根据权利要求3所述的评估方法，其特征在于，步骤（1）中室温放置2-3分钟后，加入30ulRNase-free双蒸水。