[发明专利]肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法

权利要求书

1.肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）衍生化试剂的配制：分别配制100mM的异硫氰酸苯酯和1M的三乙胺备用；

（2）色谱柱的制备：色谱仪为岛津LC-20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱（SHIMADZU  VP-ODS  5um  150*4.6mm），流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1；

（3）标准液的制备：取10ml谷氨酰胺(Gln)加入到25 ml容量瓶，用纯水溶解定溶，放入4℃冰箱保存，并逐级稀释至3/4、1/2的浓度，2倍浓度现配现用；

（4）标准液的测定和标准液测定结果处理：将步骤（3）中标准液300μl加入1.5 ml离心管中，然后加入步骤（1）中的150 μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600 μl正己烷萃取杂质，15000 pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1 ml/min，进样量5μl；制定标准曲线和标准品色谱图；

（5）取样：分别从乳鸽血液、胸部肌肉和十二指肠中取样，具体来讲，血液中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽静脉采血2ml加入到含肝素的离心管，在转速2800 pm/min温度 4℃下离心10 min，取0.4ml血液注入到20 mgSSA（5-磺基水杨酸）样品管中，涡旋混合后，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存；

胸部肌肉中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽16 d颈静脉放血后，腹部毛清理干净，剥离腹部皮肤，采集胸部肌肉，用剪刀剪成0.5 mm块，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测；

 十二指肠中谷氨酰胺(Gln)取样步骤：打开乳鸽腹腔，取出十二指肠，放于平皿中，剖开十二指肠，露出肠粘膜，除去上层肠内容物，用手术刀片刮取肠粘膜层，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测；

（6）试验样品的处理：血液样品的处理：将SSA血液样品从-80℃取出并在室温下解冻后，在3000g（5790RPM）4℃条件下离心15min，以去除蛋白沉淀，上清液转入样品管后置于样品架于4℃保存备用；肌肉和十二指肠粘膜组织样品的处理：肌肉、十二指肠粘膜组织样品在-80℃取出，称取样品0.2 g，用0.2 ml PBS（磷酸盐缓冲液）作稀释液，匀浆器中研磨，用1.0ml 0.66M冰冻后的高氯酸进行匀浆200s，匀浆后的样品于4℃、RCF为3000g离心5min，取0.8 ml上清液用0.4ml 0.66M磷酸钾中和，形成的高氯酸钾沉淀离心除去（4℃RCF为3000g离心5min）离心后的上清液在-20℃保存备用；

（7）试验样品的衍生反应和测定：分别取步骤（6）处理过的三类样品各300μl放入三个对应的1.5 ml离心管中，然后分别加入步骤（1）中的150 μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600 μl正己烷萃取杂质，15000 pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1 ml/min，进样量5μl；

（8）试验结果的处理：分别对血液样品、肌肉和十二指肠粘膜组织样品制定谷氨酰胺曲线色谱图并得出结论。

2.根据权利要求1所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中衍生化试剂的配制方法为：精确吸取1220μl异硫氰酸苯酯于100ml容量瓶中，用乙腈溶解进行定容，得到所述100mM异硫氰酸苯酯；精确吸取14.00 ml三乙胺加入100ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到所述1M三乙胺。

3.根据权利要求1或2所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法其特征在于：所述步骤（2）中流动相的配制方法为：将500毫升超纯水和3.4g无水乙酸钠用12%乙酸调节PH在6.50，与15 ml乙腈混合，超声脱气后备用得到流动相A液；将40 ml乙腈加10 ml超纯水混合脱气备用得到流动相B液。

4.根据权利要求3所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：所述步骤（4）和步骤（7）中均采用梯度洗脱，流速为1ml/min，流动相A液起始柱压为4.1MPA，测完用流动相B液小流速洗柱10 min以上。