[发明专利]酞酸酯类塑化剂通用半抗原、抗原的合成方法及应用

说明书

技术领域

  本发明涉及生物检测技术，具体为酞酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备方法及应用。

背景技术

酞酸酯（Phthalic Acid Esters，PAEs）类化合物是塑料生产中最常用的一类塑化剂，占增塑剂市场份额的88%，大约包含30种化合物，最常用的如邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）等，主要用于生产医疗制品、塑料玩具、化妆品、食品包装、农用地膜等，由于酞酸酯与产品基质间为非共价结合，致使其在生产、加工和使用过程中不断向环境中释放，已成为全球性的最普遍的一类环境污染物。毒理学研究表明：酞酸酯是一类内分泌干扰物，具有雌激素效应，并表现出一定的生物累积性，是一种具有生殖毒性和发育毒性的环境雌激素，并与肥胖症和糖尿病的发生有关。美国EPA和我国环境监测总部都将酞酸酯类化合物列为环境中优先控制的有机污染物，卫生部也将16种酞酸酯列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单（第六批）》。

目前酞酸酯的检测多采用仪器分析法，需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对检材要求较高，样品前处理和提纯过程费时费力，不能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。酶联免疫吸附法和胶体金试纸条法操作简便，对样本要求不高，可实现现场快速检测的要求。但是，酞酸酯类化合物种类繁多，常常为多个化合物同时被检出。现有的免疫分析主要针对特定的酞酸酯化合物，不能实现酞酸酯类塑化剂的多残留检测。因此，本发明以4-硝基邻苯二甲酸为原料，设计一种酞酸酯类塑化剂的通用人工抗原，为建立酞酸酯类塑化剂的多残留免疫检测技术提供基础。

发明内容

本发明针对目前酞酸酯类塑化剂免疫分析检测领域的需求和不足，提供一种酞酸酯类塑化剂通用半抗原和人工抗原的合成方法。试验数据表明，该通用抗原具有较高的免疫原性，制备的抗血清与酞酸酯类塑化剂具有良好的亲和性，抗体通用性好，灵敏度高。

一种酞酸酯类塑化剂的通用半抗原，其特征在于：其分子结构式如式（1）所示：

                                                    式（1）。

一种酞酸酯类塑化剂的通用人工抗原，其特征在于：是在通用半抗原式（1）的氨基基团上偶联载体蛋白得到的分子。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA 、钥孔血蓝蛋白KLH中的一种。

所述的酞酸酯类塑化剂的通用人工抗原的合成路线为：

工艺步骤如下。

1. 酞酸酯类塑化剂通用半抗原的制备。

（1）取10-20g的4-硝基邻苯二甲酸，加入到30mL无水乙醇，边搅拌边缓慢加入H₂SO₄，120℃反应7h，蒸馏除去反应产生的水和多余的乙醇。趁热转至冰水中，取析出固体用10%的Na₂CO₃（pH7-8）洗涤至水层无色后，用无水乙醇重结晶得到浅黄色晶体。

（2）取0.7-1.5g的浅黄色晶体溶于200mL苯中，加入纯锌粉，分次加入浓HCL，室温下搅拌12h后向反应液中加入冷水，用NaOH中和反应液至碱性，用苯进行分离萃取，萃取液经水洗后用无水Na₂SO₄干燥，蒸馏除去苯后用无水乙醇重结晶，得到淡黄色晶体，即为酞酸酯类塑化剂通用半抗原。

2. 酞酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备。

（1）制备A液：取酞酸酯类塑化剂通用半抗原加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在室温磁力搅拌下至充分溶解后，4℃下逐滴加入2.5%的戊二醛溶液，半抗原：戊二醛 = 1:2（摩尔比），避光混匀并在磁力搅拌下反应2h，得到A液。

（2）制备B液：取牛血清白蛋白，半抗原：牛血清白蛋白= 80:1（摩尔比），用pH9.6，0.05M的碳酸盐缓冲液溶解，低温保存。此液为B液。

（3）在冰水浴中将A液缓慢滴加到B液中，并在搅拌条件下继续反应过夜，即得到酞酸酯类塑化剂通用人工抗原混合液。

（4）将混合液移入透析袋中，用PBS缓冲液透析3-4天，每天更换2次PBS缓冲液。使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到酞酸酯类塑化剂通用人工抗原。

所述通用半抗原或人工抗原在制备酞酸酯类塑化剂群选性抗体中的应用也属于本发明的保护范围。