[发明专利]大丽轮枝菌致病相关基因VdNUC-2的功能分析及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病相关基因VdNUC-2的功能分析及其潜在应用的研究，属于生物技术研究领域。

背景技术

无机磷酸盐(inorganic phosphate)是生物细胞中不可缺少的重要营养物质之一，在其被吸收后，将以磷酸化合物的形式参与生物细胞的多种关键的生理生化过程。这些过程包括遗传物质脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)和核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)的合成，细胞膜结构上磷脂类物质的合成，蛋白质的磷酸化以及一切以三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)为底物的需要能量转换而完成的生化和细胞生物学反应。因此，调节和维持细胞内磷酸盐水平的稳定对于生物细胞来说显得尤为重要。

在各类真菌中，感应磷酸盐胞外浓度以及调控磷酸盐吸收的分子机理以模式菌株Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)和Neurospora crassa(粗糙脉孢霉)解析的最为透彻和深入。目前研究发现，在N.crassa中控制磷酸盐吸收的有四个基因，NUC-2，PREG，GPOV和NUC-1；而在S.cerevisiae中，有四个基因在功能上分别与之相对应，它们是PHO81，PHO80，PHO85和PHO4。PHO80是一种细胞周期蛋白，而PHO85则是细胞周期依赖的蛋白激酶。PHO85和PHO80形成复合物，通过对PHO4的超磷酸化负调控磷酸盐吸收系统(Kaffman et al.，1994)。PHO4是一个转录因子，当其抑制因子被解除后，可以激活下游参与磷酸盐吸收的各个基因的转录表达(Kang and Metzenberg，1990)。1990年，PHO81基因在酵母中被克隆；1996年，Peleg等人在N.crassa中克隆并鉴定了其同源基因NUC-2。在磷酸盐感应和吸收信号途径中，NUC-2被认为是在所有四个基因的最上游(Gras et al，2013)。当外界磷酸盐水平降低时，NUC-2通过一系列的信号作用抑制PREG-GPOV复合物(功能与PHO85-PHO80复合物相似)的活性，从而使NUC-1(功能与PHO4相似)的功能被启动，激活下游的参与磷酸盐吸收的功能基因的转录。

目前由大丽轮枝菌引起的多种经济、园艺作物的黄萎病在生产上仍为害较重，而且由于抗性品种缺乏，加之病菌定殖于作物根部和维管束系统，导致常规的防治方法很难有效控制病害。而越来越多的大丽轮枝菌致病相关基因和效应因子的发现为该病害的防治提供了潜在的、新的药物作用靶标和定向作物分子育种的技术、理论储备。

对于一部分细菌和真菌，在构建载体时，将其基因组上靶标基因两侧一定长度的同源序列进行克隆，并且将抗生素抗性基因盒连接到两者当中。利用如原生质体转化或农杆菌介导的转化方法，将这一带有同源序列的质粒导入该微生物细胞内后，细胞会在一定比例上启动核酸修复机制，而原靶标基因的核酸序列将被载体上带有抗性基因盒的序列替换，从而产生不含有靶基因的敲除突变体。而通过对敲除突变体表型的观察和检测，可以确定该基因的生物学功能及其在相关领域的应用前景。

发明内容

从大丽轮枝菌V07DF2菌株中克隆了参与磷酸盐吸收途径的VdNUC-2基因，该基因全长为6542个碱基(包括该基因的启动子、外显子、内含子和终止子，详见序列1)。根据该基因及其侧翼的核酸序列，构建了针对该基因的敲除、回补载体。利用农杆菌介导的转化方法，获得了该基因的敲除突变体和回补突变体。通过对这些转基因材料的表型观察和分析，发现VdNUC-2基因不仅控制病原菌对磷酸盐的感应和吸收，同时还影响病原菌对棉花的致病能力。另外，序列分析表明，VdNUC-2表达的蛋白质在植物和动物当中没有同源物，因此，以VdNUC-2蛋白作为杀菌剂的潜在作用靶标对于作物、动物和人都是安全、无风险的。

相关技术路线如下：

1.利用网上共享的生物信息资源，设计核酸引物，构建VdNUC-2基因的敲除载体，并将载体导入大肠杆菌和农杆菌菌株中。

2.利用网上共享的生物信息资源，设计核酸引物，构建VdNUC-2回补载体，并将载体导入大肠杆菌和农杆菌菌株中。