[发明专利]一种酶法生产α-酮戊二酸的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种生产α-酮戊二酸的方法，具体的说是酶法生产α-酮戊二酸的方法。

背景技术

α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid）是细胞糖代谢的一种关键物质，参与了很多的细胞生化代谢途径，包括三羧酸循环、氨基酸和蛋白质代谢等。α-酮戊二酸在工业上用途广泛，可作为膳食补充剂、用于合成一些杂环化合物的组件，作为人类和动物氧化应激反应的保护剂、与其他物质配合能够提高运动员成绩和促进康复等。 

α-酮戊二酸生产方法有多种，如化学合成法，微生物发酵法、酶促转化法等。化学合成法以琥珀酸和草酸二乙酯为原料经化学反应制备，由于成本过高、污染严重而被淘汰。微生物发酵法主要以诱变育种获得的荧光假单胞菌、解脂耶氏酵母等微生物以甘油、矿物油或菜籽油等原料发酵获得，该方法产量高、转化率高，是目前国外用的较多的一种方法，但该方法的缺陷在于发酵副产物较多，尤其是会有较多丙酮酸产生，而丙酮酸和α-酮戊二酸性质较为接近，给后续的分离纯化工作带来很大的困难，导致收率降低，纯化成本过高等问题。酶促转化法主要目前报道的有以L-谷氨酸为底物，利用L-谷氨酸氧化酶催化形成α-酮戊二酸，该反应结束后，体系中主要产物为α-酮戊二酸，副产物氧气和水易于除去，分离纯化工艺简单，纯化收率高。但L-谷氨酸氧化酶在常用的大肠杆菌宿主中表达困难，活性不高，提高了发酵的成本。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，利用谷氨酸消旋酶将L-谷氨酸转化为D-谷氨酸，然后利用高活性的D-氨基酸氧化酶将生成的D-谷氨酸进一步转化为α-酮戊二酸，从而有效的避免了L-谷氨酸氧化酶发酵成本过高的难题，同时也避免了发酵法产物分离纯化困难的缺陷，有利于工业化生产。

一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，以L-谷氨酸为底物，经谷氨酸消旋酶催化，将L-谷氨酸转化为DL-谷氨酸混旋物；混旋物中的D-谷氨酸与反应体系中的氧气和水在D-氨基酸氧化酶催化下生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢；随着D-谷氨酸的被消耗，L-谷氨酸在消旋酶的作用下持续生成DL-谷氨酸，直至全部转化为D-谷氨酸，并最终形成α-酮戊二酸；反应过程中生成的α-酮戊二酸在过氧化氢存在下易发生脱羧反应生成丁二酸，因此，反应体系需加入过氧化氢酶，以便将反应生成的过氧化氢水解成水和氧气，避免α-酮戊二酸被氧化。

一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，其具体生产方法的步骤为：

步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建

(1)、表达载体pET24a-glr的构建

a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；

b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；

c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a-glr；

(2)、表达载体pET24a-daao的构建

a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D-氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；

b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；

c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a-daao；

 (3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建

a、将构建好的表达载体pET24a- daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；