[发明专利]基于亚硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法

权利要求书

1.一种亚硝酸盐还原酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达亚硝酸盐还原酶的大肠杆菌；

所述的胞内亚硝酸盐还原酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1亚硝酸盐还原酶编码基因，由亚硝酸盐还原酶大亚基SG‐NC和亚硝酸盐还原酶小亚基SG‐ND构成，其核苷酸序列分别为2601bp和354bp，分别编码866和117个氨基酸，其中：亚硝酸盐还原酶大亚基SG‐NC的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；亚硝酸盐还原酶小亚基SG‐ND的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日。

3.一种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增依次得到编码亚硝酸盐还原酶大亚基及亚硝酸盐还原酶小亚基的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体pETDuet‐1，最终获得重组共表达载体pETDuet‐NC‐ND；之后将该亚硝酸盐还原酶表达载体转化到大肠杆菌表达菌株内，获得亚硝酸盐还原酶过表达重组菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括：

NC‐Nco I‐F:ACCATGGTGCCCACGGACACCTCGACCATCGT

NC‐EcoR I‐R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCGCTGTGCGCTTCCTT

ND‐Nde I‐F:GTACATATGACCCTGGCACTCGAGACGACCACC

ND‐EcoR V‐R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTTCACCTCGT。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸5min。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。

7.一种根据上述任一权利要求所述的亚硝酸盐还原酶的工程菌的应用，其特征在于，将其用于亚硝酸盐还原酶的体外高效表达，最终实现亚硝酸盐还原酶的工业发酵生产。