[发明专利]基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

氮是植物生长发育过程中最重要的营养元素之一。目前，维持或提高作物产量的主要方法是大量施肥，然而氮肥的大量施用，不仅增加了农民的生产成本，而且会加剧水体的富营养化及温室气体的排放。 

对作物而言，能够吸收同化NO₃^－、NH₄⁺及氨态N等不同氮素形态，但是一般以NO₃^－为主要氮源。植物以NO₃^－为氮源时，氮同化可以分为3个阶段：(1)氮的无机同化(NO₃^－‐NO₂‐NH₄⁺)；(2)氨的同化，即NH₄⁺经过谷氨酰胺合成酶(GS)合成谷氨酰胺，再由谷氨酰胺经谷氨酸合酶(GOGAT)合成谷氨酸；(3)氨的有机同化，即由谷氨酰胺和谷氨酸合成其它氨基酸，进而合成蛋白质和其他物质。由此可见，谷氨酰胺合成酶在氮同化通路中起着十分关键的作用。 

生物体对氮元素的同化是十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体吸收利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)是氮同化途径的关键酶，它与谷氨酸合成酶共同作用，催化NH₄⁺同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，将其酰胺转移到α‐酮戊二酸上，从而生成两分子谷氨酸。谷氨酰胺在生物体含氮有机物的生物合成中作为氮供体，而外界无机氮也必须通过这个途径才能进入生物体内的氮循环。因此谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到十分重要的作用。 

土壤中含有十分丰富的细菌群体。细菌谷氨酰胺合成酶涵盖目前发现的三大类谷氨酰胺合成酶GSⅠ、GSⅡ和GSⅢ，且相比植物谷氨酰胺合成酶基因具有种类多、易克隆等优势。灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)是一种常见的土壤细菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鉴定对于鉴定氮高效基因并应用于逆境条件下土壤理化性质的改善具有重要意义。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提出一种基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其实现方法，通过本发明所述的方法能够高效表达一种克隆自灰略红链霉菌谷氨酰胺合成酶，可以克服谷氨酰胺合成酶在原始菌株内表达量较低等缺点，有助于解决肥料利用率较低等问题，此外对于实现土壤中铵盐的快速转化进而培肥土壤，最终实现精准农业具有重大意义。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶的工程菌，该工程菌为外源表达谷氨酰胺合成酶的大肠杆菌。 

所述的胞内谷氨酰胺合成酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1谷氨酰胺合成酶大亚基基因SG‐GE，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；核苷酸序列为1377bp，编码453个氨基酸。 

所述的谷氨酰胺合成酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。 

所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。 

本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增得到谷氨酰胺合成酶编码基因；然后将该基因插入大肠杆菌表达载体pET‐22b(+)中得到含有谷氨酰胺合成酶编码基因的重组表达载体；再将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。 

所述的含有酶切位点的引物包括： 

GE‐Msc I‐F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC 

GE‐EcoR I‐R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC