[发明专利]一种以菜粕为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以菜粕为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法。

背景技术

农产品加工副产物如豆粕、花生粕和玉米蛋白粉等有机氮源已被广泛应用于各种生物产品的发酵过程中。其中，豆粕及其衍生物是许多微生物次级代谢产物(如抗生素)工业发酵的最佳氮源。相对于豆粕，菜粕是一种更为廉价的蛋白资源，但其作为发酵原料直接生物利用报道相对较少，早期研究主要集中在以菜粕作为基质固态发酵生产各种酶制剂的报道上。菜粕是一种非可溶性缓释氮源，大量的菜粕蛋白被非淀粉多糖如纤维素包裹，使得可溶性蛋白含量和游离氮的释放效率很低，一般的工业微生物难以直接利用。近年来，国际上很多研究者利用菜粕的营养特性，将菜粕经过有效的预处理后，进行液态发酵生产有机酸和微生物油脂等高附加值产品。预处理工艺使得大量的游离氨基酸从固态菜粕中释放出来，不仅提高了微生物对菜粕中氮素营养的吸收利用效率，同时也扩宽了菜粕的微生物应用范围。但是，预处理过程使菜粕利用过程中生产成本相应增加，还可能会造成菜粕中的特定营养成分的破坏或流失。菜粕作为一种特殊形式的氮源，国内外至今还没有将其直接利用进行液态发酵的报道。

伊枯草菌素A是芽孢杆菌经级代谢产生的一种具有广谱抗真菌活性的环脂肽抗生素，其分子结构由七个氨基酸残基组成的肽链和一个β-氨基脂肪酸侧链(链长C14-C17不等)构成，可广泛用于防治各种作物的真菌病害，具有抑菌持久、稳定性好、不易产生抗药性和对环境安全等优点，是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物农药。然而，由于其发酵生产成本高、产量低，严重制约着其工业化生产和商业化应用。为了进一步提高伊枯草菌素的产量、降低生产成本，目前国内外大部分研究集中在菌种筛选、遗传改良、廉价原料的使用及培养营养和环境因子的优化等方面。然而，利用未经处理的廉价菜粕作为氮源液态发酵生产伊枯草菌素，尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种以菜粕为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，利用本发明能有效降低伊枯草菌素的发酵生产成本，同时扩宽了菜粕的应用范围，实现了廉价菜粕的生物高值化利用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种以菜粕为原料液态发酵生产伊枯草菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)菌株活化：先将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis3-10)(GeneBank登陆号：JF460845，由华中农业大学陈守文教授馈赠)转斜面在28℃培养箱中培养24小时，培养基为LB琼脂培养基，得到活化的枯草芽孢杆菌；

2)摇瓶培养：挑取活化的枯草芽孢杆菌单菌落于LB液体培养基中进行摇瓶培养14小时，温度为28℃，转速为220rpm；

3)发酵罐培养：将摇瓶培养的枯草芽孢杆菌在发酵培养基中(7L发酵罐中)进行发酵，发酵条件为：接种量2-10％(v/v)(摇瓶培养的枯草芽孢杆菌的体积为发酵罐初始发酵培养基体积的2-10％)，pH7.0，发酵通风比为1～2：1(vvm)(通风比为一分钟内通过单位体积发酵培养基的空气体积比)，搅拌转速300-800rpm，发酵72小时；

所述发酵培养基组成：菜粕60-90g/L，碳源20-40g/L，K₂HPO₄·3H₂O1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，MnSO₄·H₂O0.005g/L，水1L；

4)分别收集发酵上清液和菜粕残渣：发酵后的固液混合物经离心处理后，上清液为含伊枯草菌素粗品；沉淀为发酵后的菜粕残渣，对发酵后的菜粕残渣干燥，干燥后的菜粕残渣可作为富含益生菌的饲用蛋白使用，还可作为具有抑菌功能的生物有机肥使用；

含伊枯草菌素粗品(上清液)经甲醇抽提后采用超高效液相色谱检查伊枯草菌素含量，发酵后的菜粕残渣经冷冻干燥处理后，检测芥子碱和硫甙等抗营养因子含量。

所述碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麸皮、淀粉中的任意一种或任意二种以上按任意配比的混合(含任意二种)。

所述菜粕经粉碎过40-80目筛。