[发明专利]一种发酵生产青蒿酸的方法

说明书

本发明提供了一种发酵生产青蒿酸的方法，包括在发酵液中加入少量有机溶剂，将产物从发酵液中转入有机相中，达到延长生物合成的时间和效率，提高产量、简化提取工艺的目的。本发明所提供的技术方案减少了生产工序，提高生产效率，简单易行，适合于工业化生产。

技术领域

本发明涉及工业微生物技术领域，具体涉及一种发酵生产青蒿酸的方法。

背景技术

疟疾这种疾病威胁着全球三至五亿人的健康，2010年，全世界总共有2亿人次感染疟疾，并至少夺去了65.5万人的生命。

青蒿素（artemisine）是从中药黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药，是中国发现的第一个被国际公认的天然药物，在其基础上合成了多种衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素类药物毒性低、抗疟性强，被WTO批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。青蒿素等抗疟药在非洲等地广泛使用，在与疟疾的抗击中，中国药物获得非洲国家的广泛赞誉，非洲的抗疟药主要来自中国。

目前，青蒿素主要有三种生产方法，一是传统的从青蒿中提取，该方法受气候、地域的影响大，产量不稳定；二是通过化学全合成获得，此方法难度极大，成本高昂；第三种方法是采用基因工程技术通过微生物发酵获得青蒿酸，再半合成青蒿素，该方法产量高，稳定，生产成本低，是一个相对来说比较廉价、环保和高效的办法。

使用第三种方法生产青蒿素时，关键中间体青蒿酸对最终产品的收率和生产成本有很大影响。专利CN200710187922.8公开了一种通过将GYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因导入酿酒酵母细胞来获得青蒿酸基因工程菌从而生产青蒿酸的方法；US7192751B2公开了一种在宿主细胞中导入不同的核苷酸序列编码不同的酶生产萜类化合物的方法；US7541172B2公开了一个编码多肽的独立DNA序列，其具有合成萜类化合物的活性，并通过将该序列导入细菌、酵母、植物细胞来生产萜类化合物；文献Engineering a mevalonatepathway in Escherichia coli for production of terpenoudes (Vincet JJ Martin等，Nat Biotechnol. 2003 Jul; 21(7): 796-802.)构建了一种合成紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因和来自酿酒酵母中大肠杆菌中的甲羟戊酸类异戊二烯途径的表达。文献Production of the artemisinin precursor amorpha-4,11-diene by engineeredsaccharomyces cervisiae（Ann-Louise Lindahl等，Biotechnol Lett. 2006 Apr;28(8):571-80.）介绍了两种不同的从青蒿紫穗槐-4,11-二烯合成酶编码基因转化到酿酒酵母中的方法。

上述文献主要关注生产青蒿酸前体的基因工程菌的构建，对发酵过程中产物的产量的提高关注较少。青蒿酸发酵过程中随着产物量的不断积累，将会对生产菌株本身造成毒性，从而抑制产物的继续合成。普遍的，由于有机溶剂会杀死菌丝体，因此在发酵中很少会使用有机溶剂，即使有些发酵过程用到的消泡剂和分散剂是有机溶剂，但其用量也是非常少的。发明人意外的发现通过在发酵过程中向发酵液中加入水不溶性有机溶剂，所使用的水不溶性有机溶剂不仅不会杀死菌体，而且还可以在发酵的同时，将产物从发酵液中萃取到溶剂中，减轻产物对菌体的毒害作用，使生物合成可以继续下去，从而显著提高发酵单位。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以有效提高青蒿酸发酵单位的方法，从而降低生产成本。

为实现上述目的，本发明采用了下述的技术方案：

一种发酵生产青蒿酸的方法，包括以下步骤：

1）将种子液接入到含发酵培养基的发酵罐中培养，培养14~18小时后，向发酵罐中连续补加葡萄糖和乙醇至发酵结束；