[发明专利]一种融合蛋白质、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质生产，分析和应用领域，具体涉及一种融合蛋白质的制备方法及其应用。

背景技术

钙调素蛋白是一种重要的蛋白质，在与细胞内钙离子相关的信息传递中发挥重要的调节作用，具有调解多种酶的功能。市场上，除了作为研究钙调素结合蛋白质需要大量的钙调素蛋白外，利用钙调素和钙调素结合蛋白依赖钙离子存在的关系，近来也有通过添加或消除钙离子的存在来达到结合和分离钙调素结合蛋白质的目的的报道。但是利用融合蛋白(此处是麦芽糖结合蛋白-钙调素蛋白融合蛋白)来达到分离，浓缩样本中的靶物质的方法还没有任何报道。

最近有报道指出，热休克蛋白90是很好的癌症检测标记物，但还没有一种可以从生物样本中浓缩该热休克蛋白90，便于提高该蛋白质的检测灵敏度的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过融合蛋白质来简化蛋白质的生产，纯化，分析过程以及利用融合蛋白质所依附的条件来分离，浓缩相关的蛋白质结合物的方法及其应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种融合蛋白质的制备方法，包括以下步骤：

(1)将完整的靶基因的cDNA片段克隆到融合蛋白的表达载体，cDNA克隆时，在完整基因的cDNA片段前，起始密码子(ATG)之后，加上Xa因子位点异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脱氧核糖核酸序列；

(2)将步骤(1)得到的含有完整目的基因的亚克隆表达载体，转型或转染到表达宿主细胞内，使之在宿主细胞内表达所需融合蛋白质，通过接种培养，获得含有完整目的基因载体的纯克隆细胞株；

(3)使用步骤(2)含有完整目的基因载体的纯克隆细胞株，进行量化培养，蛋白表达处理，获得量化的，有目的融合蛋白质的宿主细胞；

(4)将步骤(3)得到的宿主细胞进行裂解，获取细胞裂解液，对蛋白质进行纯化，获得分离，纯化的融合蛋白质；

(5)使用因子Xa处理融合蛋白质，可获得纯化的目的基因蛋白质。

进一步地，所述步骤(1)中加上Xa因子位点异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)的脱氧核糖核酸序列，可以保证所表达的蛋白质在Xa切割后，获得的目的蛋白质的氨基酸顺序是所需的，完整的。

进一步地，所述步骤(4)和(5)是通过亲和柱来进行蛋白质分离和纯化的。

优选地，所述一种代表性融合蛋白为钙调素融合蛋白，是以钙调素为目的蛋白质的钙调素蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合蛋白质。

通过上述的制备方法，制备得到的融合蛋白。

一种融合蛋白质的应用，利用分离纯化获得的融合蛋白，分离、纯化和浓缩目的蛋白质，可用于蛋白质的性能分析和应用。

进一步地，利用融合蛋白，富集生物样本中的靶分子，达到分离、纯化、浓缩和提高检测灵敏度的目的。

优选地，所述目的融合蛋白质为麦芽糖结合蛋白-钙调素蛋白的融合蛋白，可用来结合和浓缩样本中的一种靶分子为热休克蛋白90。

本发明具有以下优点：

本专利所介绍的融合蛋白质生产，分离纯化和分析方法，以及利用融合蛋白质来分离，浓缩相关的结合蛋白质或蛋白质结合物，达到分离，纯化和提高分析，检测靶分子的灵敏度的目的，是首次提出由融合蛋白质来富集样本中的蛋白质结合物的新方法，其方法和产品，可弥补特定蛋白质和蛋白质结合物的分离，纯化和检测方法等方面的许多不足，或提供更有效的蛋白质生产系统，其应用价值很大。本发明使用融合蛋白质的表达，生产方式，首先可提高可溶性比例，同时又简化了分离纯化的操作过程，降低了成本(利用亲和柱，方法简单，成本低)；利用设计在两种蛋白质连接处切割部位，可以容易地获得符合所需氨基酸顺序的融合蛋白质和目的蛋白质(不多一个氨基酸，也不少一个氨基酸)，便于比较融合蛋白质和目的蛋白质的可利用性能；利用融合蛋白质作为载体来分离，浓缩相关的结合蛋白质或蛋白质的结合物，可用于结合蛋白质的分离，浓缩，性能分析，检测，同时也可以作为提高生物检测灵敏度的一种新的有效方法。例如，钙调素蛋白在有钙离子存在的条件下，可与多种热休克蛋白质结合，而热休克蛋白质特别是肿瘤细胞可以分泌热休克蛋白质90，所以热休克蛋白质90又是癌症检测的重要标记物，利用此发明技术产品，浓缩相关样本中(如：血液等样本)的热休克蛋白质，将有助于癌症的早期的高灵敏度检测。

附图说明

图1是显示麦芽糖结合蛋白质和钙调素蛋白质融合蛋白质的克隆示意图；

图2是显示钙调素蛋白质的生产和纯化示意图；