[发明专利]黄连素在治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及黄连素在治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

黄连素，又名小蘗碱，是一种异喹啉衍生化的生物碱，它可从多种中草药如白毛茛、黄柏、黄连等中分离，是这些中草药的主要成分。迄今为止，黄连素在临床上一直作为非处方药治疗如痢疾杆菌、大肠杆菌引起的肠道感染、腹泻；除此之外，国内外许多药理学研究发现黄连素具有抗肿瘤、降血糖降血脂、抑制内皮细胞凋亡及血管平滑肌细胞增殖以及调节免疫系统、抗心力衰竭、抗心律失常以及抗动脉粥样硬化等功效。上述所列出的以往研究结果，不仅扩大了黄连素的应用范围，也提示黄连素的药理作用具有多种生物活性，但是目前对黄连素在心肌缺血再灌注方面的研究几乎近于空白。鉴于黄连素来源广泛、价格低廉，加之毒副作用小，如能对其相关药理效应及其作用机制进行深入研究，有望为缺血再灌注损伤的防治提供一种有效、安全、价廉的新型药物。

目前黄连素的应用领域局限于抗感染、肿瘤、调整血脂血糖以及抗动脉粥样硬化炎症反应等方面的研究，但是针对心肌缺血再灌注损伤过程的自噬调节，国内外研究一直少有涉及。缺血再灌注造成心肌细胞损伤的机制尚未完全阐明，目前公认的机制可能为：细胞线粒体功能失衡、细胞内钙离子超载、大量活性氧自由基产生等，最终导致细胞死亡。一般认为，在心肌缺血再灌注损伤中导致心肌细胞死亡的形式只有凋亡和坏死两种形式，但近年研究证实心肌细胞内存在第三种机制调控心肌细胞的存活或死亡，即自噬作用。它与凋亡类似，通过启动细胞内部信号通路，形成级联式信息传导和相应基因表达，诱导细胞死亡。然而，有幸的是，这些调控细胞死亡的不同方式在过程上具有可干预性，在时间上有延迟性，这为寻求抑制细胞死亡的途径或方法提供了空间，而以往对黄连素的研究在这些方面的效应均未予以探及。

发明内容

本发明的目的是基于黄连素原来临床应用及其他领域研究的基础，提供黄连素在治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，为缺血再灌注损伤的防治提供一种有效、安全、价廉的新型药物。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明通过以下方法研究黄连素在心肌缺血再灌注损伤过程中的保护作用，寻找黄连素在缺血性心脏病领域旧药新用的研究依据：

1)通过构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，证实黄连素对心肌细胞自噬水平的影响，说明黄连素能有效的提高经缺氧再复氧处理后的心肌细胞活力，并且它的这种保护作用是通过抑制细胞自噬水平达到。具体步骤为：

a.心肌细胞经缺氧再复氧处理后，观察黄连素对自噬水平的影响，采用CCK-8检测细胞活力，ATP试剂盒检测细胞ATP含量。

b.电子显微镜观察各组细胞内自噬体/自噬泡的形成数量，Westernblot检测各组细胞的自噬相关蛋白变化(LC3-II/LC3-I比值)。

2)构建在体心肌缺血/再灌注模型，证实黄连素对心肌细胞自噬水平的影响，说明黄连素能有效的提高心肌缺血再灌注后心功能水平，减少心肌梗死面积，且黄连素是通过抑制心肌自噬水平发挥心脏保护作用。具体步骤为：

a.将实验S-D大鼠分为假手术组和自噬抑制组：假手术组，仅开胸，于前降支放结扎线但不结扎，缺血再灌注组，缺血30min，再灌注180min，缺血再灌注+黄连素干预组，术前2h腹腔内注射黄连素，然后前降支结扎，心肌缺血30min，再灌注180min；缺血再灌注+低剂量(5mg/kg)黄连素干预组，术前2h腹腔内注射黄连素，然后前降支结扎，心肌缺血30min，再灌注180min；缺血再灌注+高剂量(10mg/kg)黄连素干预组，术前2h腹腔内注射黄连素，然后前降支结扎，心肌缺血30min，再灌注180min；

b.分别行心功能检测：持续记录分析左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩峰压(LVPSP)、LVDP；

c.Evansblue、TTC双重染色法测定心肌梗死面积：在再灌注快结束时，重新结扎前降支，从尾静脉注射3mlEvans蓝液，然后处死大鼠，取出心脏，TTC染色，非缺血区为蓝色，梗死区为白色，缺血区为红色，判断黄连素对心肌梗死范围的影响。

d.Westernblot检测各组细胞的自噬相关蛋白变化(LC3-II/LC3-I比值)。

3)通过Westernblot方法检测Beclin1、Bnip3、SirT1、AMPK、p-AMPK(Thr172)、mTOR、p-mTOR(Ser2481)等蛋白表达水平，研究黄连素影响心肌细胞缺血再灌注损伤自噬水平的分子机制，明确黄连素影响心肌细胞缺血再灌注过程中自噬的分子机制和信号传导通路。