[发明专利]用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料、功能材料和检测分析技术领域，特别涉及一种用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片及其制备方法。

背景技术

生物芯片技术是上世纪80年代末才发展起来的一项新技术，它将生命的化学过程转化为一种可控制的静态形式。它将大量的生物大分子探针、基因片段、寡聚核苷酸等按特定方式排列在特殊载体的固定位置上，在特定条件下与待检样品进行作用，通过精密的扫描仪器进行记录、检测、分析。检测型生物芯片中发展最快应用最广的是核酸芯片技术，其利用核酸分子可以变性、杂交的特性，通过核酸芯片上固定的探针或样品核酸与游离的样品核酸或探针杂交来推断未知的靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。

生物芯片的基础是基片，基片是生化反应的载体。核酸芯片从选择的基片方面可以分为两类：一类是在光滑的基片表面直接进行化学修饰；另一类是在光滑的基片上构筑微纳结构后再进行化学修饰。在光滑的基片表面直接修饰其方法简单、成本较低、便于制备，但是存在的缺陷是点样点不规整、核酸固定量小、信号强度低。另一类是在光滑的基片上构筑微纳结构后再修饰，其微纳结构增大了比表面积，使核酸固化量增大，但是其点样点同样不规则、不整齐、不集中，给信号扫描、检测、分析带来不便。所以，这种单一构筑微纳结构并不能对核酸分子实现定点限域可控的检测，另外如何降低检测限、提高灵敏度仍是核酸芯片技术一直面临的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片。

本发明的再一目的在于提供一种成本低廉、制备简单快捷、光学性质良好、化学性质稳定、表面均一、点样点规整、背景值低，具备定点限域富集作用的用于核酸生物分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法。

一种用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片，是用功能化硅烷试剂(2)修饰纳米二氧化硅超亲水微井(1)，其特征在于：功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰上了功能化基团(Functional groups，简称F)如环氧基、氨基、巯基等，以便于配基结合，形成具有生物特异亲和性的功能化微井芯片如环氧基功能化微井芯片、氨基功能化微井芯片、巯基功能化芯片等；作为纳米二氧化硅功能化微井芯片的载体可以选择光学性质良好的玻璃片、石英片中的一种；功能化微井芯片的厚度即纳米二氧化硅基底的厚度为10μm～25μm。

所述的用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片的制备方法，制备步骤如下：

(1)清洗基片，氮气吹净，烘箱烘干，然后将基片以恒定的速度于稳定燃烧的蜡烛火焰上方反复平移数次，在基片表面物理沉积得到均匀分布的、具有一定厚度的炭纳米颗粒；将沉积好炭纳米颗粒的基片放入含硅化合物的气相沉积容器中，得到二氧化硅包覆炭颗粒的纳米复合结构，高温煅烧去除炭核，从而得到均匀具有微米厚度的空心纳米二氧化硅基底；

(2)将步骤(1)得到的纳米二氧化硅基底等离子体处理后，采用单分子膜自组装法，在其表面修饰十八烷基三氯硅烷(OTS)；

(3)将步骤(2)得到的由十八烷基三氯硅烷(OTS)修饰的纳米二氧化硅基底用圆形图案光掩模板覆盖，采用光刻技术紫外光降解未覆盖区域的十八烷基三氯硅烷(OTS)，得到具有定点限域功能的以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井；

(4)将步骤(3)得到以纳米二氧化硅为基底的超亲水微井放入功能化硅烷化试剂的乙醇溶液中反应，功能化硅烷试剂通过共价键在纳米二氧化硅超亲水微井区域修饰功能化基团，然后用乙醇反复洗涤，晾干后放入烘箱120℃烘干，得到用于核酸分子痕量检测的功能化微井芯片。

本发明的功能化微井芯片利用纳米二氧化硅超亲水微井定点限域可控及对目标分子具有良好浓缩富集效果的优点，可以对核酸生物分子(DNA、RNA)实现痕量检测，从而降低了检测限，提高了灵敏度，降低了检测成本。

实验结果表明，本发明的以纳米二氧化硅超亲水微井为基底的功能化微井芯片对核酸固化链具有良好的共价键合作用，对目标核酸链和荧光标记链具有很好的富集效果，放大了检测信号，可以对核酸生物分子实现痕量检测，提高了检测的准确性。

所述的功能化微井芯片的厚度即二氧化硅层厚度是由炭纳米层厚度和含硅化合物沉积时间所控制的：炭纳米层厚度可根据基片在蜡烛火焰上方移动速度、次数来调控，最佳选择是基片以2cm/s的速度在蜡烛火焰上方平移7次～15次；含硅化合物沉积时间为24h～48h。