[发明专利]多肽类核酸载体、其制备方法及用途

说明书

本发明涉及核酸载体，具体涉及包含细胞透膜肽和具有α‑螺旋双亲性结构的抗菌肽的多肽类核酸载体。本发明还涉及含有所述核酸载体和核酸分子的复合体。本发明还涉及所述核酸载体和核酸载体/核酸分子复合体的制备方法以及用途。本发明的核酸载体具有很高的转染效率，并且具有制备方法简单，细胞毒性低等特点，为基因治疗提供了有效的治疗手段。

技术领域

本发明涉及核酸载体，具体涉及多肽类核酸载体。本发明还涉及含有所述核酸载体和核酸分子的复合体，以及所述核酸载体和核酸载体/核酸分子复合体的制备方法及用途。

背景技术

美国食品药品管理局(FDA)定义基因治疗是通过转录或翻译、转运和/或整合到宿主基因组中外源基因进行治疗疾病的一种治疗方法。基因治疗是治疗癌症、单基因疾病、心血管疾病和神经性疾病等的潜在的最有效的治疗方法。自1990年，基因治疗第一次进入临床试验开始，全球已经有超过1800例基因治疗临床试验开展。我国更是在2004年，成为第一个在市场上引进基因药物(Gendicine)的国家。由于用于基因治疗的核酸药物分子具有分子量大、富含大量负电荷以及极易降解等特点，目前基因治疗面临的最大难题是缺乏理想的转运载体，因此寻找高效、安全的基因转运载体成为研究的重点。

目前开展的临床试验大多采用腺病毒和逆转录病毒作为基因药物的载体，但病毒载体的缺点在于转运能力低、使用成本高昂和潜在的安全性等。在1994年，因为在临床试验中使用病毒基因载体造成病人死亡，致使基因治疗研究一度陷入停滞。因此，近些年非病毒类载体研究发展迅速，包括脂质体、阳离子聚合物和多肽等。非病毒载体转运基因药物多数通过自身的阳离子与基因药物的阴离子之间的离子相互作用负载DNA或RNA，形成较小尺度的纳米颗粒，转运DNA或RNA进入宿主细胞，进而整合到宿主基因中进行表达。多肽以其较好的生物相容性、功能多样性和易于合成等特点成为基因治疗载体的较好选择。

细胞透膜肽(Cell-Penetrating Peptides,CPPs)是一类能够高效介导核酸、蛋白等生物大分子透过细胞膜进入细胞的一类短肽，一般肽序列长度不超过30个氨基酸，大部分透膜肽富含赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸。其中，TAT(49-57)(HIV tat protein)是细胞透膜蛋白肽片段中可完全行使细胞透膜功能且无细胞毒性的最小片段，TAT(49-57)肽序列为Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RKKRRQRRR)。该段透膜肽可以通过在生理条件下碱性氨基酸的正电荷与核酸的负电荷结合，负载核酸进而通过内吞作用介导核酸进入细胞，并且TAT肽片段有一定的细胞核靶向能力。然而，通过内吞作用进入细胞的TAT/DNA或RNA复合体首先进入内涵体(endosome，一种内部呈酸性环境的脂膜结构)，最终运送至溶酶体降解。富含精氨酸的透膜肽肽序列R_n(n＝6-10)也具有和TAT相似的特性。由于TAT和Rn缺乏逃逸内涵体的能力，因此很难单独作为递送DNA的载体达到理想的转染效率。

实现内涵体逃逸的方法主要有两种，一种是利用酸性环境(pH6.0)下具有离子缓冲作用的材料，通过质子泵作用破坏内涵体，使DNA或RNA复合体逃逸；另一种是利用带有α-螺旋双亲性结构的多肽与脂膜作用，形成空洞，释放出来DNA或RNA复合体。具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽(AMPs)是一类可以有效促进内涵体逃逸的功能多肽。该类多肽在水性环境中呈无规则状态，但在疏水性环境中会形成α-螺旋的双亲性结构，进而起到破坏内涵体脂质囊泡的作用。

发明内容

本发明针对基因转运过程中需要解决的关键问题，设计合成了一类具有较高转染效率并且能够较好实现内涵体逃逸的多肽类核酸载体，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及核酸载体，所述载体含有细胞透膜肽和具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽(AMPs)。

在本发明的实施方案中，所述抗菌肽位于细胞透膜肽的N端方向。