[发明专利]抗PMI蛋白的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及识别非抗生素类安全筛选标记PMI(磷酸甘露糖异构酶)的单克隆抗体，该抗体可用于制备检测转基因植物中的PMI蛋白的试剂盒，属于生物检测领域。

背景技术

随着转基因产品的不断涌现，随之而来的问题就是转基因产品的安全评价及测定。在转基因品种的培养和后期鉴定中，离不开针对转化的筛选标记和报告基因，最常用的筛选标记包括抗生素抗性类筛选标记基因和抗除草剂基因，这类抗性筛选标记基因有可能会通过基因漂移造成基因污染，对环境产生不利影响(魏伟，马克平.如何面对基因流和基因污染[J].中国农业科技导报，2002，4(4):10-15)。另外，含有该种标记基因的转基因食物有可能不会被人类的肠道系统吸收利用，还很有可能产生毒副作用。所以，为降低生物安全风险，减少对环境和生物的潜在危害，目前对转基因植物的筛选已经逐渐由利用抗生素抗性筛选，过渡到以PMI为代表的非抗生素抗性筛选，最终实现更安全的无标签(Marker-free)筛选鉴定体系。

在糖类代谢中，PMI基因编码的磷酸甘露糖异构酶(phosphomannoseisomerase，PMI)催化甘露糖-6-磷酸转变为果糖-6-磷酸，然后在磷酸果糖激酶的催化作用下生成能进入糖酵解途径的果糖-1，6-二磷酸(MilesJS，GuestJR.Nucleotidesequenceandtranscriptionalstartpointofthephosphomannoseisomerasegene(manA)ofEscherichiacoli[J].Gene，1984，32:41-48)。研究发现几乎所有植物细胞除了肉桂和一些豆类，都没有PMI基因，但在细菌、酵母、动物以及人体中却广泛存在(MalcaI，EndoRM，LongMR.Mechanismofglucosecounteractionofinhibitionofrootelongationbygalactose，mannoseandglucosamine[J].Phytopathology，1967，57:272-278)，目前已从这些生物体中克隆到该基因，并获得纯化蛋白(ProudfootAEI，TurcattiG，WellsTNC，etal..Purification，cDNAcloningandheterologousexpressionofhumanphosphomannoseisomerase[J].Eur.J.Biochem.，1994，219:415-423.)。

自1998年首次报道了将PMI基因作为筛选标记用于甜菜的转基因以来(JoersboM，DonaldsonI，KreibergJ，etal.Analysisofmannoseselectionusedfortransformationofsugarbeet[J].Mol.Breed.，1998，4:111-117)，PMI/甘露糖筛选体系作为一种新型的安全筛选系统已被成功运用于多种单子叶植物和双子叶植物的遗传转化中无论是筛选标签选择、更替的过程，还是在后代选择中通过同源重组将筛选标签从生物体基因组“删除”的过程中都需要对标签蛋白进行跟踪鉴定。此外，对这些标签蛋白进行检测还可以监测品种培育过程中对环境的影响，结合特异功能靶蛋白的鉴定，可以开展农业生产中的种子纯度鉴定，食品、药品加工过程的非转基因身份保持(IP)，从而实现对转基因植物从源头到餐桌的全程监控。

基于外源蛋白的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，可实现对转基因植物样本快速、准确、高效的检测。其技术关键是制备具有高度特异性的抗体，直至目前为止还没有关于PMI抗体的报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种针对转基因植物中常用筛选标记基因PMI蛋白的单克隆抗体杂交瘤的制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种特异性好、亲和力高的抗PMI单克隆抗体，该抗体能特异结合PMI重组抗原和转基因材料。

本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于以水稻为代表的转基因生物的检测方法。

本发明的第四个目的是提供一种利用本抗体与PMI的结合能力，完成表达PMI蛋白在转基因植物、转基因动物、转基因微生物、细胞或其他材料中的分选和富集方法。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明首先制备了两株分泌抗PMI抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：