[发明专利]一种无创性获取胎儿完整基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，具体地说，是关于一种无创性获取胎儿完整基因组DNA的方法。

背景技术

产前诊断是在胎儿出生前，利用各种技术方法诊断胎儿是否患有遗传病或先天性疾病的一种手段，是人类细胞遗传学、分子遗传学、生物化学和临床医学实践相结合的一门学科。通过产前诊断，对可能出现遗传病或与遗传因素有关的疾病以及具有其他导致畸胎因素的高风险胎儿提供充足可靠的信息，科学指导妊娠期的抉择或适当治疗，达到减少缺陷儿出生率从而实现国家优生优育的目标。

现有的产前诊断技术主要包括有创性产前诊断和无创性产前诊断两种类型。有创性产前诊断主要包括羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血取样、胎儿镜和胚胎活检等，以羊膜腔穿刺和绒毛取样两种最常用，是目前产前遗传诊断的主要方法。然而，对胎儿有创取材时存在以下风险：1、胎儿一过性心动过缓；2、0.1％～0.9％的被检者发生早产或胎儿宫内死亡；3、脐带取血后脐带胎盘渗血；4、羊膜腔内感染；5、羊膜破裂；6、胎儿畸形。无创性产前诊断包括超声波检查、母体外周血清标志物测定、无创胎儿基因和细胞遗传学分析等。

在无创性方法中，超声波检查应用最为广谱，但其只能从形态上分辨一些有明显先天畸形的胎儿，对于形态正常而带有其它遗传缺陷的胎儿则无法鉴别。采用来自母体外周血液中的胎儿细胞或者母体血浆、血清中胎儿核酸进行无创性产前诊断的新技术显然具有更大的应用前途。孕妇血浆及血清中存在胎儿游离DNA及RNA，通过提取母体血液的总DNA和RNA，可用于唐氏筛查、鉴定男性胎儿、诊断RhD血型不合性溶血等。然而由于现有技术无法从母体血液总DNA和RNA中分离出完整的胎儿基因信息，绝大多数的遗传病都无法以类似的无创方法进行检测。妊娠期间，由于胎盘界面的胎儿-母体输血，少数胎儿细胞可通过胎盘屏障进入到母体循环中，主要有三种细胞：滋养细胞、淋巴细胞和胎儿有核红细胞(fetalnuclearredbloodcells，FNRBC)。FNRBC在孕早期存在于胎儿循环中的数量最多，提示其在母体循环系统中存在数量也较多；另外FNRBC在孕妇外周血中的寿命十分有限，任何利用FNRBC进行的产前诊断都不可能受到既往妊娠的FNRBC的影响。因此FNRBC是孕早期从孕妇外周血中分离胎儿细胞用于产前诊断的最佳细胞类型。但由于FNRBC在母体外周血中的数量极其有限，各种报道的分离、富集、鉴定胎儿有核红细胞的方法，都存在操作繁琐，缺乏经济实用性的缺陷，无法达到无创产前遗传诊断的要求。由于现有技术都无法彻底解决产前遗传诊断的物质基础问题，因此，有必要提供一种精确、简单、高效的无创性获取胎儿完整基因组DNA的方法。

发明内容

为了克服现有报道的分离、富集、鉴定胎儿有核细胞的方法中存在的操作繁琐、缺乏经济实用性的缺陷，本申请的发明人结合个体遗传特征鉴定的方法，可直接定位胎儿有核细胞，利用激光捕获显微切割技术，切割胎儿细胞，从而精确获得胎儿来源的全基因组DNA，为无创性产前遗传诊断应用奠定了物质基础。

因此，本发明的目的在于提供一种精确、简单、高效的无创性获取胎儿完整基因组DNA的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种无创性获取胎儿完整基因组DNA的方法，包括以下步骤：

A)从母体(孕妇)外周血中分离有核细胞；

B)制备有核细胞涂片；

C)对比分析胎儿特有或父源特有(母源无)遗传标记；

D)合成胎儿特有或父源特有(母源无)遗传标记探针，标记胎儿有核细胞；

E)显微切割分离被标记的胎儿有核细胞；

F)对切割所得胎儿有核细胞单细胞进行高保真全基因组DNA扩增。

根据本发明，所述母体(孕妇)外周血为妊娠5～38周的母体(孕妇)外周静脉血。

根据本发明，所述对比分析胎儿特有或父源特有(母源无)遗传标记包括使用SNP组合或STR组合的个体遗传标记分型鉴定。

根据本发明，所述合成胎儿特有或父源特有(母源无)遗传标记探针，包括使用SNP探针、STR探针或其组合。

根据本发明，所述合成胎儿特有或父源特有(母源无)遗传标记探针还包括使用生物素、地高辛、dinitrophenyl、aminoacetylfluorine或其组合进行探针标记的步骤。

根据本发明，所述标记胎儿有核细胞包括应用原位杂交技术进行标记。

根据本发明，所述原位杂交技术包括荧光原位杂交技术。

根据本发明，所述荧光原位杂交技术包括单色荧光原位杂交、多色荧光原位杂交、DNA纤维荧光原位杂交或其组合。