[发明专利]磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法

权利要求书

1.一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于：其包括缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、磁珠悬浮液D、缓冲液E、缓冲液F、缓冲液G七种组分；

所述缓冲液A终浓度组成为：20-50mmol/L葡萄糖、10-30mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5-20mmol/L乙二胺四乙酸，溶剂为高压灭菌水，缓冲液A终PH=8.0-8.5；

所述缓冲液B终浓度组成为：15-25mg/ml蛋白酶K、1-5mol/L盐酸胍、5-25mmol/L柠檬酸钠、1-2%曲拉通、0.5-5mmol/L EDTA，溶剂为高压灭菌水，缓冲液B终PH=4.0-5.5；

所述缓冲液C成分组成为：无水乙醇溶液；

所述缓冲液E终浓度组成为：1-5mol/L醋酸钠，体积分数为20-40%无水乙醇，溶剂为高压灭菌水，缓冲液E终PH=4.0-5.5；

所述缓冲液F终浓度组成为：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L EDTA、5-25mmol/L柠檬酸钠和0.3-0.7 L/L的无水乙醇，溶剂为高压灭菌水 ，缓冲液F终PH=8.0-8.5；

所述缓冲液G终浓度组成为：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L EDTA，溶剂为高压灭菌水，缓冲液G终PH=8.0-8.5；

所述磁珠悬浮液D成分组成为：每200mmol/L氯化钠水溶液中含有50mg单分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS纳米磁珠；

所述单分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS纳米磁珠通过以下步骤制备得到：

（1）溶剂热法制备单分散的四氧化三铁纳米球；

（2）采用改进的Stöber法，在四氧化三铁纳米球外包覆二氧化硅，得到单分散的Fe₃O₄@SiO₂纳米球，具体为：称取0.1g步骤（1）制备得到的四氧化三铁纳米球，向其中依次加入20ml去离子水、80ml无水乙醇和1ml质量分数为28%的氨水，超声混合均匀后向混合液中加入1ml正硅酸乙酯， 20°C下机械搅拌6小时；反应完毕后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球，将所得产物在60°C烘箱中干燥待用；

（3）使用硅烷偶联剂氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷对步骤（2）获得的Fe3O₄@SiO₂进行硅烷化处理，得到Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS；具体为：称取0.1g步骤（2）得到的Fe₃O₄@SiO₂纳米球，加入到20ml二甲基甲酰胺中，超声分散后得到溶液A；将10ml的氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷和20ml的二甲基甲酰胺混合均匀后，加入一定量的丁二酸酐使得混合溶液pH值维持在3.9~4.1，60°C下机械搅拌3小时，得到溶液B；将溶液A、B混合后加入20ml去离子水，在60°C下继续机械搅拌5小时后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的硅烷化的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS。

2.一种权利要求1所述的试剂盒提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取待测细菌培养液1-1.5ml置于2.0ml EP管中，12000 rpm离心1-3min，收集菌体，加入150-300μl 缓冲液A；

（2）向步骤（1）EP管中加入150-300μl缓冲液B，45-65°C水浴孵育5-10min；

（3）向步骤（2）孵育后的EP管中加入150-300μl缓冲液C，混匀后静置5-10min；

（4）向步骤（3）静置后的EP管中加入10-50μl磁珠悬浮液D，将EP管置于磁力架上，静置10-60s后去除液体；

（5）将步骤（4）EP管从磁力架上取下，加入200-600μl缓冲液E，混匀混匀后将EP管置于磁力架上，静置10-60s后去除液体，再将EP管从磁力架上取下，加入200-1000μl缓冲液F，抽打混匀或振荡混匀后将EP管置于磁力架上，静置10-60s后去除液体，室温静置5-10min；

（6）将步骤（5）EP管从磁力架上取下，加入50-100μl缓冲液G，混匀后将EP管置于45-65°C水浴孵育5-10min，取出后将EP管置于磁力架上静置10-60s后将上清液转移至收集管中，完成细菌DNA的提取。