[发明专利]一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及手性苯丙氨酸(L-苯丙氨酸)，尤其是涉及一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法。

背景技术

手性氨基酸(天然L-氨基酸和非天然D-氨基酸)是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化工品的关键中间体。许多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等)的制备需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而众多手性氨基酸的合成离不开氧化还原酶的催化，因此寻找高选择性的氧化还原酶成为手性氨基酸研究的热点。

苯丙氨酸主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌药物的中间体和良好载体，通过L-苯丙氨酸可以把抗肿瘤药物载入肿瘤所在的部位，不但可以抑制肿瘤生长，而且又可降低肿瘤药物的毒性。随着甜味剂二肽阿斯巴甜(APM)投放市场，L-苯丙氨酸作为它的主要原料，需求量急剧增加(Gerigk MR,Maass D,Kreutzer A,et al.Enhanced pilot-scale fed-batch L-phenylalanine production with recombinant Escherichia coli by fully integrated reactive extraction[J].Bioprocess Biosyst Eng,2002,25:43-52)。D-苯丙氨酸营养价值虽小，但具有出色的镇疼作用。临床实验已表明，对一批长期用各种疗法无效的肌肉疼、关节疼、腰腿疼患者疗效显著，并且无明显副作用。

苯丙氨酸在人体内不能合成，必须由外界供给，因此研究其合成方法很有必要。苯丙氨酸的制备方法通常有两种，即化学合成法和微生物发酵法。化学合成法的收率较低；需使用剧毒的氰化物，污染环境；副反应较多；工艺路线长等缺点。而微生物发酵法具有环境友好，节能绿色等优点，缺点是发酵产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格。全细胞催化苯丙酮酸不对称还原胺化获得手性苯丙氨酸，具有反应路线简洁，易实现辅酶再生等优点。1984年，Humme等人(Wemer Humme,Norbert Weiss.Isolation and characterization of a bacteria possessing L-phenylalanine dehydrogenase activity[J]Arch Michobiol,1984,137:47-52)首次报道具有苯丙氨酸脱氢酶的短杆菌(Brevibacterium sp.)，通过与甲酸脱氢酶反应体系相偶联，使辅酶NADH得以再生，使得在同一个生物反应器中连续转化苯丙酮酸生成L-苯丙氨酸。因此，筛选含有催化不对称还原胺化高活性高选择性的苯丙氨酸脱氢酶的菌株是实现手性苯丙氨酸有效制备的关键。来源于海洋微生物的氧化还原酶具有一些陆地酶所不具有的特性，如广泛的底物谱、耐盐性、耐有机溶剂等特性，使得其受到更多的关注。

发明内容

本发明的第一目的在于提供南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15A2。

本发明的第二目的在于提供一种海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法。

所述南海芽孢杆菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15A2，已于2014年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.8969，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述海洋菌株催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：

1)细胞液制备：将菌种接入2216L培养基中培养，得发酵液，离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；