[发明专利]低免疫原性抗TNF-α全人源单抗及其应用有效
申请号: | 201410390493.4 | 申请日: | 2014-08-08 |
公开(公告)号: | CN104341502A | 公开(公告)日: | 2015-02-11 |
发明(设计)人: | 孙乐;张小刚;李茂华;樊贵宝;孙哲;张翠娟 | 申请(专利权)人: | 北京天成新脉生物技术有限公司 |
主分类号: | C07K16/24 | 分类号: | C07K16/24;C12N15/13;A61K39/395;A61P35/00;A61P29/00;A61P19/02;A61P37/02;G01N33/68;G01N33/577 |
代理公司: | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人: | 王文君 |
地址: | 101111 北京市经济技*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 免疫原性 tnf 全人 源单抗 及其 应用 | ||
技术领域
本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用,主要是涉及特异性针对人TNF-α的抗体及其应用。
背景技术
TNF-α是一种在炎症和免疫应答中自然出现的细胞因子。研究发现在类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜液中,TNF-α水平升高,并在病理性炎症和关节破坏方面起重要作用。目前一般采用单克隆IgG抗体或者可溶性的TNF-α受体来中和体内的TNF-α。市售的单抗有如下:英夫利昔是人源化的TNF-α鼠单克隆抗体,依那西普是由两条人TNF-α受体(p75)偶联到Fc端的融合蛋白。利用放射性标记的TNF-α进行结合能力测定,结果显示英夫利昔能结合单体(无活性)及三聚体(有活性)类型的可溶TNF;依那西普更倾向于结合有活性的聚体形式的TNF-α及TNF-β。阿达木(adalimumab)单抗是美国雅培公司研制的一个全人的TNF-α单克隆抗体,其可特异性地与TNF结合并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用。但adalimumab单抗在宿主体内免疫原性较强,高达26%以上的患者使用该单抗会发生免疫反应,这给临床患者的使用带来了风险和不便,同时药物半衰期也相对较短,使用的过程中也需要增大药物剂量来弥补该方面的缺陷。基于此,若能够在不影响抗体亲和力和特异性的前提下,通过将抗体中高免疫原性的非抗原结合位点换成低免疫原性的同源序列来降低抗体药的免疫原性,则一方面可使单抗的安全性得到提高;另一方面可增加药物半衰期,在减少其用剂量同时也能起到提高疗效的作用。目前未见低免疫原性TNF-α的抗体的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体。
本发明的另一个目的在于提供一种制备低免疫原性全人源抗TNF-α的单克隆抗体的方法。
本发明利用商业化的DNAStarTM软件对阿达木单抗(购自美国雅培公司)的原始序列进行评价,结果显示,阿达木免疫原性系数为16。利用上述软件对抗体的可变区里面的非抗原结合片段(FR)进行免疫原性评价,找到免疫原性强的相关序列。随后,查找人抗体基因库中所有涉及轻重链的FR区段,通过比较后选择出一些免疫原性相对较低的区段。将区段中相应变动的部分分别得同阿达木单抗中对应的区段进行替换,随后用Pymol蛋白分子模拟软件进行3D建模,选择保持了原有的抗原结合位点的序列进行基因合成,测序,选择测序正确的序列。
本发明的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体,即是在原始阿达木序列的轻链可变区和重链可变区的FR区进行氨基酸改造,降低其免疫原性,所述原始阿达木序列的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.23、24所示。
进一步地,本发明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体,其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11~15或SEQ ID NO.23任一所示,其重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.16~20任一所示。
更进一步地,本发明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体,其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示,其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。编码其的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9所示。
本发明提供的全人源的抗人TNF-α单克隆抗体,其轻链可变区具有L1至L5(SEQ ID NO1~5所示)这五条碱基序列所示的任一个轻链可变区序列,重链可变区具有h1至h5(SEQ ID NO.6~10所示)这五条碱基序列所示的任一个重链可变区序列。
具备上述轻链可变区和重链可变区的组合中,本发明共筛选得到10个单抗序列,它们既保持了原有抗原结合位点、又与人TNF-α结合的亲和力和原始adalimumab抗体相近,可特异性地阻断TNF-α与细胞表面TNF受体p55和p75的结合。
这10个单克隆抗体都具有相同的CDR区域且具有同样的功能,但对这10个抗体FR区域中某些氨基酸进行了不同的调整,这可使它们的免疫原性得到有效的降低。
本发明的提供编码上述10个单克隆抗体轻链可变区和重链可变区的基因。
本发明得到的10个低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体,分别为L3h2、L3h4、L5h2、L4h1、L4h2、L4h4、L1h3、L2h1、L0h4、L2h5、
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