[发明专利]一种噻唑橙类菁染料分子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于活细菌检测的分子的结构设计及其在细菌检测技术中的应用。本发明涉及的噻唑橙类菁染料分子(简称BOMA)能应用于细胞染色、细菌检测技术领域，利用细胞内酯酶活性是否存在作为判断细菌生存状态的依据，通过在荧光定量PCR反应中抑制死细菌的DNA扩增，达到定量检测样本中活细菌含量的目的。

背景技术

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一，在世界食品安全领域中备受关注。而在自然环境中，微生物以多种生理状态存在：可培养的活菌，处于非可培养状态的活菌(Viable but Nonculturable，VBNC)，具有完整结构但无生物活性的死菌(“Ghosts”)以及膜损伤死菌。只有“活菌”才保留有原菌的毒力和致病性，对食品安全造成潜在的威胁，而经过高温、紫外线等各种途径灭活处理的细菌已丧失了其致病性，因此食源性致病菌检验的关键是食品中“活”的致病菌是否存在和准确定量。

目前用于区别活菌和死菌的标准主要有：是否可培养，是否有代谢活性以及细胞膜是否完整。分离培养法对于活的非可培养状态的细菌会出现漏检。现有活菌PCR技术(EMA/PMA-qPCR活菌检测技术)实际上是通过细胞的膜的完整性来对“死”、“活”细胞进行区分检测。该活菌检测技术是利用新型核酸染料EMA(叠氮溴化乙锭)或PMA(叠氮溴化丙锭)渗入膜损伤的细胞后，与DNA发生共价结合，从而抑制膜损伤细胞DNA在PCR反应中的扩增。该方法利用EMA/PMA分子中的溴化乙锭、溴化丙锭不能穿透细胞膜的特性，选择性对膜损伤细胞的DNA进行结合，之后在可见光的作用下，使交联基团与DNA发生共价交联，达到在PCR反应中抑制被交联的DNA扩增的效果。然而细胞膜损伤可能是细胞死亡的一种极端表现形式，以细胞膜的完整性作为区分死、活菌的检测标准存在缺陷。首先，理论上EMA/PMA不能进入活的细胞内，但对一些具有可逆性的部分膜损伤细胞(如存在于环境样本中的细菌)以及部分膜完整的活菌，染料仍会穿透细胞膜，造成不同程度的活菌DNA损失，产生假阴性结果。其次某些灭菌方法不直接作用于细胞膜，如紫外线灭菌法，冷冻灭菌等。这种情况下，不能采用基于EMA或PMA的活菌PCR方法来评估灭菌方法的效果，否则会造成活细胞数目的严重高估。因此，以细胞膜的完整性作为区分活菌和死菌的检测标准仍有缺陷，而基于生物代谢活性的活菌分析将克服PMA-qPCR方法在原理上的不足，能直接通过细胞内代谢活性的有无对死、活细菌加以区分。尽管少数死亡细胞仍会残留微量的代谢活性，但在绝大多数情况下，这种活性丧失的速度快于膜的损伤，或大致相等。因此，建立一套基于生物代谢活性的活菌分析方法，使其既可有效检测出活菌(包括VBNC菌)，又可克服原有活菌检测技术方法在原理上的不足，对于膜完整或膜损伤的死细胞不检测，同样符合致病菌检测的根本要求。

发明内容

本发明目的是提供一种基于细菌酯酶活性检测活细菌的噻唑橙类菁染料分子。

本发明另一目的是提供该种分子的应用。

本发明是一种用于活细菌检测技术的噻唑橙类菁染料分子结构及其在活细菌检测中应用。该分子结构将噻唑橙类染料从分子探针的设计、应用，拓展到用于活细菌检测的分子设计、应用。应用该分子结构设计的分子可用于细胞染色及细菌检测技术领域，通过利用该分子自由穿透细胞膜的特性，通过细胞内酯酶活性判断细菌生存状态，以及在荧光定量PCR反应中对死细菌DNA扩增的抑制作用，达到定量检测活细菌含量的目的。

一种噻唑橙类菁染料分子，分子结构如下：

R为C2～C5的烷基。

具体分子结构为：

该分子结构包括：结合基团、酶标基团、交联基团，以及连接部位四部分。以连接部位R为C2的烷基为例，上述基团位置如图1所示。

上述噻唑橙类菁染料分子用于活菌含量的检测以及对细胞进行快速荧光染色。

本发明通过下列步骤实施：

根据化学反应式

化合物I’由化合物I与叠氮乙醇反应得到；反应在如下溶剂中进行:N,N-二环己基碳二酰亚胺、N,N-二甲基甲酰胺或上述溶剂的混合溶剂；反应中需加入碱作催化剂如4-二甲氨基吡啶；通常反应从0℃到30℃；反应时间约需1到24小时；反应完成后一般用乙醚提取收集，经干燥后得到化合物I’；得到的产物用NMR等方法来证明。