[发明专利]一种牡丹酚的层析分离纯化方法

权利要求书

1.一种牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)细胞破碎：把冷冻保存的牡丹丹皮在破碎前一天取出，在室温下解冻→称取牡丹丹皮提取物悬液，记录体积和质量→加入等体积PBS→样品装在烧杯中，使用超声细胞粉碎机进行细胞破碎；在冰浴下用玻棒沿烧杯壁轻轻搅动，使破碎更完全，破碎后的样品记为样品1；

(b)盐析：将上述步骤(a)取得的样品1→冷冻离心，除去沉淀→加入固体(NH₄)₂SO₄，使其达到饱和→静置→冷冻离心，除去沉淀→在上清液中加入(NH₄)₂SO₄，使其达到饱和→静置→冷冻离心，除去上清液，所得样品记为样品2，其中固体(NH₄)₂SO₄用量是参考硫酸铵沉淀试剂表，(NH₄)₂SO₄用前先碾匀，加(NH₄)₂SO₄的过程要缓慢，并一边轻轻搅拌，加完(NH₄)₂SO₄后继续搅拌几分钟；

(c)透析：收集上述步骤(b)盐析后所得的沉淀，装入透析袋，排除气泡，用透析夹封住袋口，将装有样品的透析袋置于合适容器中加入PBS缓冲液，开始透析，当透析数小时，所得的样品记为粗提液；

(d)选择柱层析：在牡丹丹皮提取物牡丹酚分离纯化过程中，不同的层析柱在洗脱条件方面不尽相同，在柱型及洗脱条件的选择上参考各种填料的性质并进行改进；

(e)装柱：选取合适规格层析柱→竖直固定柱子→调整流出管高度→往预加水/缓冲液的柱子中，小心装入处理好的填料→平衡，装柱过程应避免气泡产生，用蓝色葡聚糖2000过柱，检验装柱效果；

(f)上样走柱：在上样前，用搅拌器小幅度搅动，使柱顶端部分填料重悬→静置→待液面与柱面相隔高度h时，沿层析柱内壁旋转加入样液，注意不要破坏柱面；

(g)洗脱干燥：样品完全进入柱体后，加入洗脱缓冲液，调整好各相关仪器，开始洗脱，洗脱结束干燥后获得牡丹酚成品。

2.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(a)中加入等体积PBS为50毫摩尔，该PBS的PH数值为6.8。

3.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(a)中细胞破碎的周期间隙时间为1s，超声时间为2s，总时间为30min。

4.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(b)中加入固体(NH₄)₂SO₄，使其达到饱和的质量百分比为28％；在上清液中加入(NH₄)₂SO₄，使其达到饱和的质量百分比为50％。

5.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(b)中冷冻离心和静置的最佳温度为4℃。

6.根据权利要求1或5所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(b)中的冷冻离心时转速是8000rpm，时间为30min。

7.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(c)中加入PBS缓冲液为10毫摩尔。

8.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(e)中的填料为HA、DEAE、快流速DEAE-琼脂糖凝胶和葡萄糖凝胶G-X系列，其中葡萄糖凝胶G-X系列包括葡萄糖凝胶G-25和葡萄糖凝胶G-200。

9.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(f)中液面与柱面相隔高度h的范围是0.2～3mm，最佳值为1mm。

10.根据权利要求1所述的牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于：步骤(g)中的相关仪器至少包括梯度洗脱器、搅拌器、恒流泵、核酸蛋白检测仪及记录仪和自动部分集器。