[发明专利]检测CpG ODN序列纯度的方法及应用

说明书

发明所属领域： 

本发明涉及一种使用HPLC进行脱氧核苷酸纯度检测的方法，具体地说，本发明涉及一种使用反相柱、适宜的流动相和洗脱程序进行CpG ODN纯度的检测。 

背景技术：

CpG-ODN是以非甲基化的CpG二级核苷酸为核心，具有免疫刺激作用的核苷酸序列。早在19世纪90年代，人们就发现给癌症患者注射细菌提取物能明显减轻病情，后来研究表明，细菌DNA具有直接的免疫刺激作用和抗肿瘤作用。通过合成的寡聚脱氧核苷酸进行实验研究，发现细菌DNA的免疫刺激作用和其中的非甲基化CpG二核苷酸(CpG)有关。 

CpG-ODN能促进B细胞增殖分化并分泌IL-6，从而诱导抗体的分泌；激活单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等抗原提呈细胞分泌多种细胞因子，诱导细胞内病原体产生细胞免疫。因此CpG-ODN作为佐剂提高疫苗免疫效力成为研究热点。目前，Coley公司、Dynavax公司、云南沃森的国内外三家公司开展了CpG ODN作为乙型肝炎疫苗的佐剂进行了研究。 

CpG ODN采用化学合成是经硫代修饰的单链脱氧寡核苷酸高分子聚合物。合成过程中工艺采用固相亚磷酰胺合成法，在DNA自动合成仪上进行。按照设定的碱基长度和序列，经脱保护→偶联→硫代→封闭的多次循环，使DNA寡核苷酸链得以加长。合成产物在浓氨水条件下去除固相支持物并脱去磷酸和碱基的保护基，得到5’端和3’端都带羟基的硫代寡核苷酸。 

化学合成DNA过程中可能存在“n-”，“n+”系列产物。化学合成DNA不及活细胞内DNA复制具有高保真性，其每次合成循环的错误率约为1/100，通常缺失一个碱基(n-1)或两个碱基(n-2)，相反也存在着合成过程多了一个碱基(n+1)或两个碱基(n+2)的情况。 

反相液相色谱是一种以疏水作用为基础的色谱分离模式。由于它具有分辨率高、重复性好、回收率高等优点，在蛋白质及多肽的分离分析中得到了极为广泛的应用。其特点是固定相的极性比流动相弱。由于RPLC固相载体的疏水性，它可以根据流动相中被分离物 质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离。疏水性较弱的样品分子和固定相间的相互作用较弱，因此较快流出；反之，疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用，在柱内保留时间相对较长。 

CpG ODN为硫代产物本身随链长度的增加疏水差异性减小，这就使得常规反相HPLC对这些失败序列(相关物质)的分析变得较为困难，在现有技术中，通常采用比用比色法检测CpG ODN纯度，如王学菊刘璟等”MTT比色法建立B型CpG ODN活性检测标准”(《细胞与分子免疫学杂志》2008年01期,69-71),人未甲基化寡聚脱氧核苷酸ELISA检测试剂盒，在中国专利CN100526876C一种未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测方法，公开了采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶，然后利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法对修饰和未修饰的DNA水解样品中5-甲基胞嘧啶含量做测定，并通过修饰和未修饰的DNA水解样品中5-甲基胞嘧啶检出量的差别而对CpG进行定量，但这些方法稳定性差，重复性低，特别是作为疫苗佐剂使用时，要求纯度高的CpG ODN，且疫苗中的CpG ODN需精确定量，因此该方法在疫苗制品纯度的检测中存在局限性。 

目前CpG ODN佐剂的纯度检测的另外一种方法为毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)检测。该方法优势为成本低，操作较为简便，劣势为重现性差，对PH值要求较高，不易应用到实际生产中。且其检测主要设备之一毛细管电泳仪价格昂贵，设备普及率低，使用该方法检测对于中小企业或资金有限的科研院所会造成较大压力。本发明所述方法采用高效液湘开展反相液相色谱层析，降低了检测初期对设备要求的成本。而高效液湘普及率较高，一般的高校及科研院所均有配备，因此租借设备或委托检验比较方便。本发明所述方法的优点在于投入资金较少的情况下仍能取得良好的检测结果，且操作简单，重现性能好，易于应用到实际生产中。 

发明技术内容： 

本发明的目的是提供一种基于RPC-HPLC技术的CpG ODN纯度检测方法，该方法能把CpG ODN合成过程中缺失的一个碱基(n-1)、两个碱基(n-2)，或多了的一个碱基(n+1)、两个碱基(n+2)与主要产物(n)分离开，对CpG ODN序列纯度进行精确检测，弥补现有CpG ODN序列或核酸纯度检测工作的不足。