[发明专利]苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3AaBb及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3AaBb及其编码基因和应用。

背景技术

农作物病虫害是我国的主要农业灾害之一，它具有种类多、影响大、并时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度对我国国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。据统计，我国每年因病虫害损失粮食近500亿斤、各类经济作物1800万吨。过去为了防治作物的各种虫害，化学农药被广泛使用，然而，一方面由于长期大量使用农药，导致部分昆虫产生了一定的耐药性或抗性，致使农药的使用剂量在逐年增加或使用全新的农药；另一方面，由于长期过度使用化学农药，导致人类赖以生存的环境受到不同程度污染。因此，需要寻找更好的途径防控各种病虫害。随着生物技术的发展，利用抗虫基因培育抗虫转基因植物是一条行之有效的途径。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是植物外源抗虫基因的重要供体菌，其毒性活性主要源自芽胞形成时所产生的伴孢晶体毒素，即杀虫晶体蛋白(insecticidal crystalline protein，ICP)，包括晶体毒素(crystalline toxin，Cry)和细胞裂解毒素(cytolytic toxin，Cyt)。ICP是由Cry基因和Cyt基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。

已报道的杀虫晶体蛋白基因有748种，很多已广泛应用于抗虫转基因育种中。然而，由于大部分商业化利用的转基因作物均为杀虫晶体蛋白类，随着这些转基因作物种植面积的扩大，害虫对单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。因此寻找新的抗虫基因显得尤为重要。

科学家经过不懈的努力，从一些营养生长时期的Bt菌株中分离得到具有杀虫毒性的非伴孢晶体杀虫蛋白，合成后即被分泌到胞外，这就是被称为第二代抗虫蛋白的苏云金芽胞杆菌的营养期杀虫蛋白(vegetativeinsecticidal protein，Vip)。Vips主要分为Vip1、Vip2、Vip3和Vip4四种类型共108个杀虫蛋白，其中77个蛋白属于Vip3。Vip3的杀虫谱和杀虫活性与ICPs不同，前者对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用，且抗虫谱更广。目前，这些基因被广泛应用于抗虫转基因水稻、玉米和棉花育种。

然而，Vip3基因的资源毕竟是有限的，而且不同的基因间的抗性存在比较大的差异，同时细菌的基因是富含AT的，这势必影响基因在植物中的表达，对相应基因进行人工改造，可以进一步提高基因的利用效率。

文献(Fang et al.,Characterization of chimeric Bacillus thuringiensis Vip3toxins,Applied and Environmental Microbiology,2007,73(3):956-961；方军，苏云金杆菌营养期杀虫蛋白Vip3基因及其在转基因水稻中的应用，2008，博士论文，浙江大学图书馆)通过将Vip3Ab2的N端或C端与Vip3Aa1的C端或N端嵌合，人工合成Vip3AbAa和Vip3AaAb，结果表明，嵌合基因的杀虫谱更广，而且对部分昆虫的杀虫活性更高。因此，通过人工合成嵌合基因是改造Vip3基因的有效途径。

发明内容

本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3AaBb，该苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白能在植物细胞中高效表达，对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等昆虫具有较高的杀虫活性。

一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)营养期杀虫蛋白Vip3AaBb，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3AaBb的编码基因，其碱基序列如SEQ ID No.2所示。该编码基因是通过以下思路设计并合成的：

(1)获取Vip3Aa1基因(GenBank Accession No：L48811)中编码Vip3Aa1蛋白N端451个氨基酸的1353个碱基序列；

(2)获取Vip3Bb1基因(GenBank Accession No：DD319826)中编码Vip3Bb1蛋白C端350个氨基酸的1050个碱基序列；

(3)嵌合步骤(1)和(2)获得的两个碱基序列，获得一个初步改造的原始碱基序列；