[发明专利]慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用。

背景技术

分子影像学(molecular imaging，MI)的概念，是指活体状态下在细胞和分子水平上应用影像学方法对体内分子的生物化学过程进行定性和定量研究可以直观地显示特定分子在体内的生物学行为。在分子影像学诞生之前，无法观察活体内微小肿瘤病灶和早期的微转移，更无法直观、无创地观察肿瘤细胞在活体内发生、发展以及转移等变化。分子影像学不仅可以可以解决以上问题，还可以在活体动物上获取肿瘤发生、发展、侵袭以及转移机制方面的分子生物学信息。生物发光成像仪是近年来发展起来的一项分子、基因表达的分析检测系统，可以将报告基因即荧光素酶(Luciferase，Luc)基因通过IRES和目的基因相连，当体内报告基因表达后，产生萤火虫素酶，同时外源注入相应的底物后，萤火虫素酶与萤火虫素酶反应将产生荧光，利用生物发光成像仪就可以检测到此荧光，从而反映目的基因的表达。此类技术的主要优点是无辐射，可以连续、实时、无创、定量、直观地检测肿瘤细胞的生物学行为，因为只有报告基因的表达产物与底物(如D-luciferin)发生反应才能检测到信号，所以只对活的细胞成像，且没有背景噪声的影响。分子成像技术具有以上诸多优点，所以可将此技术应用于临床和基础研究。将分子成像研究引入肾癌干细胞基因治疗具有其他方法无可比拟的优势，将解决在活体内无创、实时、直观、定量地检测肾癌干细胞的各种生物学行为的难题。

肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，近年来肾癌发病率与致死率呈逐年上升。由于对其发生、发展和恶化机理的研究一直未见明显突破，加之肾癌对放射治疗和化学治疗都不敏感，所以肾癌的基因治疗显得尤为重要。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)是目前已知的人体最强的血管生长抑制因子，是最有希望成为治疗肿瘤和血管增生性疾病的候选基因。PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族蛋白。PEDF对维持眼内组织无血管状态具有重要作，可能是维持角膜，玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因。在大鼠脉络膜新生血管(CNV)模型中，注入编码PEDF基因的Adenovirus(Ad-PEDF)，能在视网膜表达PEDF蛋白和mRNA，使CNV受到显著抑制。正常视网膜组织中VEGF和PEDF含量保持平衡，VEGF和PEDF比值改变与新生血管形成程度呈正相关，表明PEDF作为血管抑制剂参与了血管形成的调控。

PEDF抑制肿瘤细胞生长主要通过：诱导肿瘤细胞分化和诱导肿瘤细胞凋亡的途径。最近研究显示：PEDF可以调节IκB磷酸化，或者使其降解，从而调节NF-κB活性。Morais等研究发现NF-κB的激活可以促进肾癌的发生、发展和转移，并且他们发现用四氢吡咯二硫代氨基甲酸盐(PDTC)抑制NF-κB的活性，具有抑制肾癌细胞增殖及促进其凋亡的作用。在基因治疗过程中，基因表达的作用在很大程度上受到转染效率的限制，提高转染效率是一个关键的环节。慢病毒是一种逆转录病毒载体，不但能感染分裂期的细胞并整合到其基因组中，而且还可以感染非分裂期的细胞。

目前慢病毒作为载体包装质粒技术已广泛的应用于基因治疗领域。现有技术中未见报道慢病毒介导的靶向PEDF在在抑制肾细胞癌血行转移中的应用。通过上述研究有望为肾癌的治疗提供一个新的方法，也为临床应用PEDF基因治疗肾癌提供实验依据。

发明内容

本发明提供了一种慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用的方法，达到利用慢病毒作为载体包装质粒抑制肾癌细胞增殖的目的。

慢病毒载体介导PEDF在抑制肾细胞癌血行转移中的应用，该方法主要步骤如下：

(1)采用RT-PCR扩增PEDF、IRES、Luc基因，测序并鉴定，将其导入质粒进行扩增；

(2)采用Luciferase PCR产物以限制性内切酶BamHI/XhoI接入pBobi载体，得到pBobi-Luc，构建pBobi-Luc载体，对pBobi-Luc(+)质粒进行扩增、提纯，鉴定；