[发明专利]一种观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法

权利要求书

1.一种观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)将动物肝脏组织，经PBS清洗，4v/v％多聚甲醛水溶液固定8～12h，石蜡包埋，连续切片；

(2)对步骤(1)得到的石蜡切片进行脱蜡，抗原修复，封闭，荧光标记抗体孵育；

其中，所述的脱蜡，将石蜡切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，60℃烘片2～6小时，置于二甲苯中脱蜡30分钟，取出，再放入新鲜的二甲苯中再次脱蜡10分钟；之后，进行梯度酒精复水；

其中，所述的抗原修复，室温下将脱蜡后的切片置于10mM、pH 6.0的枸橼酸缓冲液修复液中，用微波炉100％火力处理3min至微微沸腾，再用50％火力维持7min，停止加热后自然冷却20～30min；去离子水清洗3次，每次5min；再用PBS清洗5min，用滤纸擦去标本外的PBS；

其中，所述的封闭，是用封闭液室温下孵育封闭1h，倾去封闭液；所述的封闭液用含0.3v/v％TritonX-100的PBS将山羊血清稀释至5～10v/v％；

其中，所述的荧光标记抗体孵育，是用Alexa488Conjugate的β-Tubulin(9F3)Rabbit单克隆抗体稀释液4℃湿盒孵育标本过夜；之后，用PBS 3min×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS；滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚避光孵育2～5min，对标本细胞核进行标记，用PBS 1min×3次洗去4',6-二脒基-2-苯基吲哚，用滤纸擦去标本外的PBS，最后用甘油封片；

(3)对于甘油封片后的标本，在24h内使用激光扫描共聚焦显微镜观察，488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚分别在488nm和405nm下激发，室温、暗室环境下立即观察，拍片。

2.根据权利要求1所述的观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，其特征在于，步骤(1)中，切片厚度为4～5μm。

3.根据权利要求1所述的观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，其特征在于，步骤(1)或(2)中，所述的PBS为0.01M、pH 7.2的磷酸缓冲液。

4.根据权利要求1所述的观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的梯度酒精复水，使用以下溶剂依次浸泡：100v/v％酒精3min，100v/v％酒精3min，95v/v％酒精水溶液3min，85v/v％酒精水溶液3min，75v/v％酒精水溶液3min，50v/v％酒精水溶液3min，去离子水3min，去离子水3min，0.01M、pH 7.2PBS 5min。

5.根据权利要求1所述的观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，其特征在于，步骤(2)中，荧光标记抗体孵育过程中，单克隆抗体稀释液配制方法如下：用含0.3v/v％TritonX-100和1％牛血清白蛋白的PBS稀释单克隆抗体，单克隆抗体的与PBS的体积比为1:500～1:800。

6.根据权利要求1所述的观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，其特征在于，步骤(3)中，激光扫描共聚焦显微镜为Zeiss公司的LSM 710激光扫描共聚焦显微镜。