[发明专利]鉴定双翅目昆虫的分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体的说是一种鉴定双翅目昆虫的分子生物学方法。

背景技术

桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)是一种世界危害性检疫害虫，该虫寄主范围较广，能取食香蕉，柑橘，杨桃，番石榴，芒果，茄子，辣椒等46个科250多种水果和蔬菜。该物种主要以幼虫为害，成虫产卵于果皮下，幼虫孵化后靠取食果肉发育，被危害的果实会出现腐烂和未熟先黄脱落的症状，严重影响各种水果果实的质量和品质，甚至失去食用价值。由于该虫具有寄主范围广，繁殖力高，适应能力强，危害性大的特点，给果蔬业和花卉业造成严重的经济损失，许多国家都将其列为重点检疫对象，在中国桔小实蝇被列为二类检疫性害虫。

果蝇英文俗名fruit fly或vinegar fly，广泛存在于全球温带及热带气候区，由于其主食为腐烂的水果，因此在人类的栖息地内如果园、菜市场等地区内皆可见其踪迹，与桔小实蝇一样，主要以幼虫为害，成虫产卵于果皮下，幼虫孵化后靠取食果肉发育。除了南北极外，目前至少有1000个以上的果蝇物种被发现，大部分的物种以各种腐烂的水果或植物体为食，少部分则只取用真菌，树液或花粉为其食物。对水果的危害主要见于使得樱桃等很多水果种类快速腐烂，从而造成经济损失。

丽蝇是属于双翅目丽蝇科。成虫除在肉、鱼、腐肉上产卵外，也可在人、畜的伤口内产卵，引起蝇蛆症。这种习性常为偶然现象，但在有些种类中则为固有的特性。一般卵生，少数蚴虫，即产生活的幼虫，繁殖数量极大。对人体有危害，除了造成骚扰外，部分种类具医学上的重要性，例如大头金蝇可机械性地传播肠道传染病，蛆症金蝇是专性蝇蛆症的病原昆虫，引起人畜的蝇蛆症，在经济上有重要意义。丽蝇是芒果重要的授粉昆虫，农民会以无食用价值的鱼头等，吸引丽蝇前来产卵，并为其授粉，以增加产量。由于引致人类及动物蝇蛆病的成因主要是来自狂蝇总科、丽蝇及麻蝇科，故此丽蝇很多成为治疗此病的研究对象。单单铜绿蝇在澳大利亚每年就造成超过1.7亿美元的经济损失。在人类发生的蝇蛆病主要分类6种：皮肤及皮下、面部、伤口或创伤、胃肠道、阴道及一般的蝇蛆病。蝇蛆病的幼虫一般都是在一龄阶段。现时唯一的治疗方法是清除蛆虫，让病人自行康复。

由于桔小实蝇、果蝇和丽蝇同属双翅目昆虫，其卵、幼虫和蛹很难鉴定；传统的物种鉴别主要依赖于专业的昆虫分类学家花费大量时间和精力整理积累后所描述的形态特征，存在较大的局限性，不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，极易混淆出错。其次，传统的鉴别方法难以展开针对三种幼虫或残缺个体的鉴别。

快速而准确的物种鉴定是科学经济的防治害虫的必要前提和基础。由于我国大部分地区农业生产均采取间混套作(intercropping/interplanting)模式，且桔小实蝇具有寄主范围广，繁殖力高的特点，使得这三种害虫常常得以同域混合发生。因此有必要寻找一些快捷、准确鉴别这三种害虫的分子生物学方法，从而应用于检疫和及时有效地控制其给能源作物生产带来的危害。

自2003年DNA条形码(DNA barcodes)概念出现以来，DNA条形码技术(DNA barcoding)受到生物分类学领域普遍关注，DNA条形码，也称DNA条形编码，类似于超级市场商品包装上用于识别商品的粗细、间隔不同的黑白条纹图案，线粒体细胞色素氧化酶亚基I(mtDNA COI)被用作动物类群的主要条形码序列，基于该基因片段的昆虫条形码研究在国内外广泛开展，是利用线粒体DNA的细胞色素C氧化酶亚基I基因(Cytochrome C oxidase I，COI)的前部约650bp长的序列作为标记来实现快速、准确和自动化地对物种进行鉴定和分类。DNA条形码快速而精确的特点弥补了传统形态鉴定的诸多不足，使其广泛应用于动物分类鉴定中。但是目前国内外尚无利用DNA条形码作为分子标记区别鉴定桔小实蝇、果蝇和丽蝇的报道。

因此，本发明首次通过DNA条形码，即扩增测定这三个物种线粒体DNA的COI基因序列，结合相关软件进行分析处理，实行快速简捷，经济实惠地对三种双翅目昆虫进行物种鉴定；最终为及时有效的控制桔小实蝇的危害，从而保护其危害的水果和蔬菜等植物，提高作物产量，降低作物产业成本提供必要的前提和基础。

发明内容

本发明的目的是针对桔小实蝇、果蝇和丽蝇幼虫形态鉴定难，科学鉴别手段缺乏的不足，提供一种科学有效、简便快捷、准确的桔小实蝇害虫的分子生物学鉴定方法。