[发明专利]应用于高通量测序的核酸分子定量方法

权利要求书

1.一种可以用于正常建库的核酸标准品。

2.如权利要求1所述的核酸标准品，是由一系列不同浓度的具有不同核酸序列的核酸分子组成。

3.如权利要求1所述的核酸标准品，核酸标准品的编码序列可以利用信息学分析与待测样本的中的核酸序列区别。

4.一种混合标准品与样品的文库制备方法，将权利要求1中的核酸标准品混合物与定量样本或者从定量样本提取的核酸样本按比例混合，用于测序前的文库制备。

5.如权利要求4中制备的文库，不但包括用于直接建库测序，还包括目标区域富集建库测序。

6.如权利要求4中的文库制备，不但包括单个样本的建库测序，还包括多个样本的混合建库与混合捕获。

7.如权利要求4中的核酸标准品，如果使用多重PCR建库方法，需要将标准品的特异编码序列置于上下游引物识别序列的中间，本发明优选的PCR建库标准品是经过编码的引物与人GAPDH基因片段的重组分子。

8.如权利要求4中的核酸标准品，如果使用杂交探针捕获目标区域进行测序，需要将核酸标准品的序列作为捕获区域的一部分进行探针设计，本发明优选的捕获建库标准品是经过精心编码的人GAPDH基因片段。

9.一种高通量测序方法，包含将权利要求4-8中构建好的文库上机进行高通量测序，本案中使用的仪器包括但不局限于illuminaMiseq与HiSeq测序仪，可以适用于其它高通量测序的平台，例如LifeIon测序平台，Roche454平台，ABISolid平台以及PacBioRS平台等测序平台。

10.一种基于高通量测序的特异序列浓度分析信息方法，对权利要求9中的测序原始数据进行序列比对与统计分析，得出不同浓度标准品的reads数与样本中感兴趣序列的reads数。

11.如权利要求10中所述的reads数，也可以是根据序列长度矫正后的reads数，包括但不局限于RPKM（ReadsPerKilobasesperMillionreads）。

12.如权利要求10中所述，将不同标准品的真实浓度与其reads数（或矫正后的reads数）进行函数拟合构建数学模型；将同一样本中感兴趣的序列reads数（或矫正后的reads数）代入权利要求12中数学模型，从而得到该序列的真实浓度。

13.一种利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的方法，包括：利用权利要求1-3中的标准品与待测样本或处理后的样本接触，检测测序结果中标准品与被定量分子的reads数。

14.一种利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的系统，包括权利要求1-3中的标准品的制备，权利要求4-8中的文库制备方法，权利要求9中的高通量测序方法和权利要求10-12中的数据分析方法。

15.权利要求1-8中的任一项所述标准品设计与文库制备方法和权利要求10-13中的信息分析方法用于制造核酸样本定量的制剂的用途，所述的用途例如人全基因组CNV检测，血液游离核酸定量检测，16SrRNA定量检测，并由此引申出的临床应用，例如孕妇血液游离核酸定量检测胎儿基因信息，器官移植患者的血液循环DNA定量检测排斥反应，循环肿瘤DNA的定量检测肿瘤发生与用药信息，微生物在特定环境中的数量等。