[发明专利]羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒分子生物学检验方法领域，具体涉及一种羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒。

背景技术

羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus,CPV）包括山羊痘病毒（Goatpox Virus,GTPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox Virus,SPPV）和牛疙瘩皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus,LSDV）三种，能引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极大下降，造成巨大经济损失。山羊痘、绵羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一种急性、热性、接触性传染病。绵羊痘和山羊痘，被我国列为一类传染病，对畜牧业养殖影响重大。根据不同毒株的毒力差异，易感羊群的致死率可达10%～58%或 75%～100%不等。羔羊致死率可达 100%，妊娠母羊极易流产。同时，因自由贸易受到限制造成了国家税收的下降，致使此病也成为了重要的经济疾病。该病呈世界性分布，我国近年来在如广西、贵州、黑龙江、甘肃等地也有发生。牛疙瘩皮肤病病毒引起牛的疙瘩皮肤病，又称牛结节性皮炎或牛结节疹、块状皮肤病，是以患牛发热、皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病，感染率为5%～85%，病死率为10%；我国目前尚无牛疙瘩皮肤病病毒流行的报导，国内也无检测该病的相关研究，由于印度和斯堪的纳维亚都有人类感染羊痘病毒的报道，因此，本病在公共卫生方面具有一定的意义。在印度，管理患病动物的人有的手和腿上发生红色丘疹，继而出现水疱并结痂，但未见有全身性的扩散。张瑞阳等（2003）首次报道了我国人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面颊等部位出现丘疹。携带有病毒的牛羊肉存在使人患病的可能性，对于肉制食品的安全存在潜在的隐患，因此，本发明的试剂盒和检测方法在动物产品及其食品的出入境的快速检验检疫中具有重大的意义。

羊痘病毒（Capripoxvirus,CPV）在分类上属于痘病毒科（poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（chordopoxrinae）中的羊痘病毒属（Capripoxvirus）。羊痘病毒为砖形病毒，在细胞浆内复制，其基因组为双链 DNA。其大小约为 290nm×270nm，属于较小的痘病毒，病毒粒子由1 个核心、2个侧体和2 层脂质外膜组成，羊痘病毒的衣壳为对称型，有囊膜，囊膜内含有病毒特异性蛋白。 该病毒对干燥有较强的抵抗力，在干燥的痂皮内可存活 3-6 个月，在干燥羊舍内可存活 6-8个月。反复冻融对其没有明显的灭活作用。对直射阳光、常用消毒药（酒精、碘酒等）以及乙醚或氯仿较敏感。放线菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒复制。 

山羊痘、绵羊痘和牛疙瘩皮肤病病毒很强的宿主特异性，自然条件下，不会发生交叉感染。但病毒对上皮细胞有特殊亲和力，因此无论通过哪种途径进入机体的病毒，最终都经血液达到皮肤和粘膜，在上皮细胞内增殖，引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹。山羊和绵羊均为易感动物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑随风和灰尘吸入呼吸道而感染，也可以通过损伤的皮肤及消化道传染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破溃后可从鼻、口分泌物和泪液排泄病毒。病毒进入乳汁、尿液和精液也可成为病毒传播的重要来源。被病羊污染的用具、饲料、垫草，病羊的粪便、分泌物、皮毛和体外寄生虫（如羊虱）都可以成为传播媒介。该病以春秋两季多发，主要在冬季春初流行，常呈地方性或广泛流行。气候严寒、雨雪、霜冻、枯草和饲养管理不良等因素都有助于本病的发生和加重病情。目前控制该病最有效的方法还是使用高效疫苗对易感动物进行免疫接种。本发明的试剂盒和检测方法在排查上述饲养用具、饲料、垫草，病羊的粪便、分泌物等是否含有羊痘病毒属病毒也具有重要意义。

 TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5^，末端，淬灭基团则在3^，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3^，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5^，外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。