[发明专利]一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因、重组载体和重组菌。

背景技术

植物半纤维素约占植物干重的35％，是在自然界中仅次于纤维素的第二大类可再生的生物质能。甘露聚糖是自然界中半纤维素的第二大组分，由吡喃甘露糖以β-1,4糖苷键连接而成，广泛存在于植物中。

水产养殖原料中甘露聚糖可最高占非淀粉多糖的34％。非淀粉多糖是存在于饲料中的主要抗营养因子，不被消化道所降解，遇水形成胶态溶液，使食糜粘度增大，阻碍营养物质的消化吸收，降低动物的生产性能。

甘露聚糖酶(β-mannanase；endo-β-1,4-D-mannanase；EC 3.2.1.78)是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖及甘露聚糖的内切糖苷水解酶，降解产物为甘露糖和/或甘露寡糖。根据氨基酸序列同源性，甘露聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第5和26家族，其可来源于细菌、放线菌及真菌等。

甘露聚糖酶已在饲料、造纸、食品、制药、纺织印染及石油开采等领域得到了广泛的应用。在饲料中，外源甘露聚糖酶的添加可降解饲料中的甘露聚糖，从而起到积极的作用，如降低食糜粘性并提高饲料转化率、破坏植物细胞壁结构以改善饲料营养价值、提高动物机体的免疫功能从而减少抗生素等化学药物的使用、水解产物甘露寡糖可作为营养物质促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌的增殖。

具有低温活性的甘露聚糖酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程，如水产饲料中应用的甘露聚糖酶需要在低温(10–20℃)环境下具有催化活性。目前，已报导2个具有低温活性的甘露聚糖酶(专利号：ZL201110326253.4及专利申请号：201310539350.0)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因、重组载体和重组菌。

本发明的技术方案如下：

一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种编码所述的甘露聚糖酶ManAGN25的甘露聚糖酶基因manAGN25，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的甘露聚糖酶基因manAGN25的重组载体是包含有甘露聚糖酶基因manAGN25的重组载体。

所述的甘露聚糖酶基因manAGN25的重组菌是包含有甘露聚糖酶基因manAGN25的重组菌。

所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。

所述甘露聚糖酶ManAGN25总共含371个氨基酸，理论分子量为42.2kDa。ManAGN25的N端28个氨基酸为预测的信号肽序列“MRKTKIKRYLGQLILCGTFALAAFSLRA”，成熟的甘露聚糖酶ManAGN25含343个氨基酸。经BLAST比对，甘露聚糖酶ManAGN25与GenBank中Sphingobacterium sp.IITKGP-BTPF85来源的假定蛋白(hypothetical protein)(序列号：EQB79541)具有最高的一致性，为70.9％，该假定蛋白功能还未研究，只是通过序列相似性归类于糖苷水解酶第26家族蛋白；ManAGN25与已验证功能的Sphingomonas sp.JB13来源甘露聚糖酶(AFE82293)的一致性为38.0％。以上BLAST比对结果说明该甘露聚糖酶ManAGN25是一种新的甘露聚糖酶。

本发明通过PCR的方法分离克隆了甘露聚糖酶ManAGN25的编码基因manAGN25，其全长1116bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。

本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因manAGN25，其编码的甘露聚糖酶ManAGN25的最适pH为6.5–7.0；最适温度为35–40℃，在10℃和20℃下分别具有约15％和约45％的酶活；经0.1MpH5.0–8.0缓冲液在37℃下处理60min，仍能保持60％以上的活性；37℃时半衰期约为60min。本发明的甘露聚糖酶ManAGN25为低温甘露聚糖酶，可应用于水产饲料及食品行业中。

附图说明

图1为在大肠杆菌中表达的重组甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析；其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组甘露聚糖酶。

图2为纯化的重组甘露聚糖酶的pH活性。