[发明专利]一种适用于临床的高效扩增NK细胞的培养体系的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说，是一种适用于临床的高效扩增NK细胞的培养体系的应用。

背景技术

NK细胞（natural killer cell）于1975年被发现，属淋巴细胞谱系，是含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞，为机体重要的免疫细胞。NK细胞来源于骨髓，在形态上属于大颗粒淋巴细胞，占外周血淋巴细胞总数的5%-10%，其对靶细胞的识别无MHC限制性，无需预先致敏即可直接杀伤肿瘤细胞，也可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能，是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞，在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。

目前，基于NK细胞的肿瘤生物治疗取得了较大进展，其中基于NK细胞天然免疫识别的肿瘤生物治疗途径有很多新的设想，人们通过免疫放疗和化疗方案大幅度提高NK细胞的抗癌功效。近期研究证明，适度放疗和化疗可以使肿瘤细胞高表达NK细胞活化受体识别的配基（如NKG2D），使肿瘤细胞易于被NK细胞识别而清除；同时，还发现组蛋白脱乙酰酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂可以诱导肿瘤细胞DR2，从而被NK细胞以TRAIL途径杀伤；另外，基于NK细胞的ADCC效应设计的生物治疗方案，采用治疗性单抗或治疗性双功能抗体结合NK细胞体内运输可以极大地提高临床肿瘤生物治疗的疗效。

目前临床上获得NK细胞的方法一般是从外周血单个核细胞中进行扩增，培养过程中一般需要加入动物血清来提高培养效果。然而，其主要存在以下缺陷：

① NK细胞只占正常外周血淋巴细胞的5%-20%，含量很少，从外周血中分离NK细胞成本高，且分离出来的NK细胞一般处于非活化状态，在很大程度上限制了在临床上的应用。

② 大多数体外扩增和活化NK细胞的方法都需要应用到基因工程细胞，即应用CD64、CD86修饰K562细胞构建人工抗原                                                                                                                                                           递呈细胞(aAPC)，然后将4-1BBL(CD137L)和膜固定IL15等导入此细胞中，构建CD64-CD86-41BBL-Mil15-aAPC，并利用此人工抗原递呈细胞进行NK细胞体外扩增，这种方法可以获得较强细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5-6周后细胞不再扩增。而且K562细胞是红白血病细胞，这种方法操作复杂，细胞得率低，一定程度上降低了临床使用的安全性。

③ 动物血清成分复杂，含有对细胞有害的成分，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应形成有细胞毒性作用的聚精胺、补体、抗体、细菌毒素等，这些会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；动物个体不同，血清产地、批次不同，其成分不能保持一致；取材中可能带入支原体、病毒，可能导致实验失败或实验结果不可靠；大规模生产中，血清来源困难，价格昂贵。不能适用于临床细胞治疗体系。

④ 一些NK细胞培养基产品在使用过程中需要使用大量的抗体包被培养耗材，抗体价格昂贵，增加成本。