[发明专利]杂交富集捕获DNA测序文库洗涤溶液及洗涤方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体而言，涉及一种杂交富集捕获DNA测序文库洗涤溶液及洗涤方法。

背景技术

双链核酸分子(如DNA，DNA/RNA，RNA/RNA)以双螺旋的构象存在。这种双螺旋结构是由双链中相对应碱基之间的氢键(如A+T/U或G+C)以及碱基堆积中的疏水力来稳定的。碱基互补配对原则(杂交)是涉及核酸的所有进程的中心原则。在基本的杂交反应中，核酸探针或引物被设计成与靶序列互补结合。通过杂交诱捕富集基因组DNA测序文库而进行针对目标基因组区域或一组基因的靶向测序就是利用了这一原理。

核酸杂交的效率和准确性主要取决于以下三个方面：(1)变性条件(即分离)；(2)复性条件(即重新退火)；(3)杂交后的洗涤条件。一旦核酸的互补链被分离时，“复性”或“再退火”的步骤使引物或探针结合到靶核酸的样品中。该步骤也有时被称为“杂交”步骤。在杂交富集DNA测序文库时，与基因组靶序列相结合的生物素标记的探针将与链酶亲和素磁珠紧密结合而被捕获下来。在这之后，任何没有结合的，或者非特异性错误结合的DNA序列将被通过一系列的洗涤反应而被除去。基因靶序列与捕获探针之间的特异性结合很大程度上取决于这些洗涤步骤的苛刻性。互补性高的DNA双链在这种苛刻的洗涤环境中的稳定性远高于互补性低的。因此，提高洗涤的苛刻性可以用于去除探针与基因组DNA之间的非特异性结合。

3个主要的可调节因素决定了洗涤的苛刻性：1.温度。随着温度的升高，探针与基因组DNA之间的非特异性结合将被变性，分离。2.盐浓度。随着盐浓度的降低，探针与基因组DNA之间的非特异性结合将被变性，分离。3.时间。随着洗涤时间的延长，探针与基因组DNA之间的非特异性结合将被变性，分离。其他的影响因素包括pH值和洗涤的次数也会影响洗涤的苛刻性。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够以较低成本，简单，快速，高效的实现对利用链霉亲和素磁珠和生物素标记探针结合而进行的杂交诱捕富集DNA测序文库进行洗涤的洗涤溶液配方及采用此洗涤溶液进行洗涤和后续洗脱测序文库的方法。为了达到上述目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种杂交诱捕富集DNA测序文库的洗涤溶液，其特征在于它是仅由柠檬酸钠缓冲液(SSC)及十二烷基硫酸钠(SDS)组成，所述的组分是独立包装的。

在本发明的一个优选实施方式中，柠檬酸钠缓冲液包括NaCl，和柠檬酸钠，其pH值是6.8-7.2.

本发明另一方面还涉及采用上述洗涤溶液进行洗涤文库的方法，

采用洗涤溶液包括：

洗涤溶液I：1X SSC，0.1％SDS；

洗涤溶液II：0.1X SSC，0.1％SDS；

洗涤溶液III：0.2X SSC，10％SDS

其特征在于包括如下步骤：

准备：对于每个富集反应，将1ml洗涤溶液I和2ml洗涤溶液II提前30分钟置于65℃温育，其他洗涤溶液置于室温；

将利用Invitrogen M270链霉亲和素磁珠对生物素标记杂交探针进行的捕获反应体系于600g快速离心3秒，以确保管壁管盖上没有磁珠残留；

将离心管放在磁力分离架上，放置1分钟，待液体澄清后，小心取出并弃去上清液；

取下离心管并向其中加入65℃温育的1mL洗涤溶液I，用移液枪上下混匀10次后，于65℃孵育5分钟；

将离心管放在磁力分离架上，放置1分钟，待液体澄清后，小心取出并弃去上清液；

取下离心管并向其中加入65℃温育的1mL洗涤溶液II，用移液枪上下混匀10次后，于65℃孵育5分钟；

将离心管放在磁力分离架上，放置1分钟，待液体澄清后，小心取出并弃去上清液；

取下离心管并向其中加入65℃温育的1mL洗涤溶液II，用移液枪上下混匀10次后，于65℃孵育5分钟；

将离心管放在磁力分离架上，放置1分钟，待液体澄清后，小心取出并弃去上清液；

取下离心管并向其中加入室温的1mL洗涤溶液II，用移液枪上下混匀10次后，于室温放置旋转混匀器旋转5min；

取下离心管后于600g快速离心3秒，确保管壁管盖上没有磁珠残留；

将离心管放在磁力分离架上，待液体澄清后，小心取出并弃去上清液，并用P10移液枪尽量弃去所有剩余的液体；

保持离心管置于磁力架上，从磁珠的另一面管壁加入1mL洗涤溶液III，计时30秒后，小心取出并弃去上清液，并用移液枪尽量弃去剩余的液体。