[发明专利]一种提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法。

技术背景

毕赤酵母作为目前广泛用于表达外源蛋白的重要宿主，拥有诸多优点：培养方式简便、菌株遗传稳定、蛋白表达量高、表达蛋白能够经过正确折叠和翻译后修饰。然而随着大量不同外源蛋白在毕赤酵母中的表达，发现毕赤酵母对不同外源蛋白的表达量差异较大。已有的研究主要关注于外源蛋白的分泌表达与基因拷贝数、信使RNA含量等因素之间的关系，然而最近的研究发现，外源蛋白的分泌表达量低往往是其在内质网中的聚集造成的。通过采用不同启动子或增加基因拷贝数的策略来增强毕赤酵母表达外源蛋白，相当含量的外源蛋白仍然滞留在胞内而未被分泌表达。

内质网是将分泌表达蛋白折叠成天然构象，并对不正确折叠构象蛋白进行严格筛选的主要场所。内质网驻留蛋白包括3类：折叠酶、分子伴侣和凝集素伴侣。表达分泌性外源蛋白常常使细胞内积累大量未正确折叠的蛋白，大量未折叠蛋白在内质网的滞留会对内质网造成胁迫。作为一种自我防御机制，受到未折叠蛋白胁迫的细胞会产生未折叠蛋白响应(URP)。因此，如何通过激活URP来增强细胞分泌表达外源蛋白的能力，是近些年本领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法。通过将HAC1、ERO1双基因或HAC1、ERO1、BIP三基因在毕赤酵母胞内共表达，有效提高毕赤酵母分泌型外源蛋白的表达量，从而弥补现有技术的不足。

本发明的提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法；是通过增加HAC1、ERO1基因在毕赤酵母胞内的表达量来提高的；

更进一步的，在毕赤酵母胞内还可以同时增加BIP基因的表达量；

作为实施例的优选，上述增加HAC1、ERO1基因在毕赤酵母胞内的表达量，是通过将共表达HAC1、ERO1双基因的重组质粒转化/转染入毕赤酵母中实现的；

作为实施例的优选，增加HAC1、ERO1、BIP基因在毕赤酵母胞内的表达量，是将共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒转化/转染入毕赤酵母中来实现的；

其中共表达HAC1、ERO1双基因的重组质粒、共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒的制备方法如下：

1)对质粒pGAPZαA进行改造，去掉信号肽，构建新的质粒pGAPZA；

2)在质粒pGAPZA的基础上，将酶切位点AvrII突变掉，构建新的质粒pGAPZB；

3)将HAC1基因片段连接pGAPZA质粒，构建得到重组质粒pGAPZA-HAC1；

ERO1基因片段连接pGAPZB质粒，构建得到重组质粒pGAPZB-ERO1；

BIP基因片段连接pGAPZB质粒，构建得到重组质粒pGAPZB-BIP；

4)将pGAPZB-ERO1质粒和pGAPZA-HAC1质粒分别进行酶切，连接，构建得到共表达HAC1、ERO1两个基因的重组质粒pGAPHE；

5)将pGAPZB-BIP质粒和pGAPHE质粒分别进行酶切，连接，构建得到共表达HAC1、ERO1、BIP三个基因的重组质粒pGAPHEB。

其中上述HAC1基因的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:1。

上述ERO1基因的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:2。

上述BIP基因的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:3。

本发明另一方面还提供了一种重组毕赤酵母菌株，为转化/转染了共表达HAC1、ERO1双基因的重组质粒和/或共表达HAC1、ERO1、BIP三基因的重组质粒的毕赤酵母。

本发明将构建得到的共表达质粒pGAPHE、pGAPHEB分别转化入分泌表达外源木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母中获得重组毕赤酵母菌株。重组毕赤酵母菌株能在胞内共表达HAC1、ERO1基因或HAC1、ERO1、BIP基因，进而显著提高了外源木聚糖酶的表达量。当共表达HAC1、ERO1基因时，木聚糖酶的分泌表达量比初始水平普遍提高了15％-25％；而当共表达HAC1、ERO1、BIP时，木聚糖酶的分泌表达量比初始水平提高了45％-57％。本发明提供的方法能有效提高外源蛋白在内质网中的正确折叠，进而提高毕赤酵母分泌型外源蛋白的表达量，有利于促进毕赤酵母作为酶制剂生产菌株的广泛应用。

附图说明

图1：pGAPZαA质粒图谱。