[发明专利]一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 201410396024.3 | 申请日： | 2014-08-12 |
| 公开（公告）号： | CN104195156A | 公开（公告）日： | 2014-12-10 |
| 发明（设计）人： | 黄红亮;陈瑞爱;何玲;谢小雨;任常宝 | 申请（专利权）人： | 肇庆大华农生物药品有限公司;广东大华农动物保健品股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N5/10;C12N15/66 |
| 代理公司： | 广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙) 44288 | 代理人： | 汤喜友 |
| 地址： | 526238 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 独立 表达 基因 狂犬病毒 通用 转移 载体 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其特征在于：其是在含有gEL与gER的pUC19/HEK-gE重组质粒中的gEL与gER之间插入含2个CMV启动子、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的双基因表达盒。
2.根据权利要求1所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其特征在于：所述双基因表达盒的全长基因序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其特征在于：所述表达盒在gEL与gER之间的Xba Ⅰ位点插入。
4.含有如权利要求1-3任一项所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的宿主细胞。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的构建方法，其特征在于，其具体步骤为：
1)采用PCR法从PRV基因组DNA扩增获得同源重组臂gEL和gER；
2)将步骤1)中的再克隆至pUC19载体，并经酶切补平消除Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ及Kpn Ⅰ获得pUC19/HEK-gE重组质粒；
3)合成将含2个CMV启动、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒；
4)将Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒克隆插入pUC19/HEK-gE重组质粒的gEL和gER之间。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1)的具体过程如下：以细胞培养物中抽提的PRV基因组DNA作模板，PCR扩增出两个同源重组臂gEL和gER，经相应限制性内切酶消化后先后定向克隆至经酶切补平消除HindⅢ和EcoR Ⅰ位点的pUC19/HE，获得pUC19/HE-gE，经平端化消除Kpn Ⅰ位点，获得pUC19/HEK-gE重组质粒。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤3中)Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒的合成方法为：利用DNAClub软件分析gEL、gER、pUC19、CMV启动子Pcmv及BGH pA信号各序列中的限制性酶切位点，合成Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA的双基因表达盒；其中，MCS1限制性酶切位点依次为：Hind Ⅲ、Spe Ⅰ、Mlu Ⅰ、EcoR Ⅴ、Bgl Ⅱ、Not Ⅰ、Bal Ⅰ、Pst Ⅰ，MCS2限制性酶切位点依次为：Sal Ⅰ、Kpn Ⅰ、Stu Ⅰ、EcoR Ⅰ、Cla Ⅰ、Hpa Ⅰ、BamH Ⅰ、Acc Ⅲ、Nru Ⅰ、Xho Ⅰ。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，上述合成方法还包括在Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒两端引入Xba Ⅰ位点。
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