[发明专利]一种可视化鉴定美洲大蠊的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计美洲大蠊的可视化探针序列，如下：

探针I，方向为5’-3’：

AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA

其中，方框框住部分为前缀序列；与划横线部分序列反向互补，起到沉默空白的作用；粗体字部分为G-四联结构；

(2)模板DNA的提取：提取待检标本的基因组DNA；

(3)COI序列的制备：以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，以LCO1490和HCO2198为引物对进行PCR反应，再将PCR产物纯化，得到COI序列；

LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；

(4)可视化扩增：以步骤(3)得到的COI序列为模板，以LCO1490和探针I为引物对进行PCR反应；

(5)显色和结果判断：向步骤(4)得到的可视化扩增产物中加入NaCl溶液，变性和复性；接着加入氯铁血红素反应，再加入H₂O₂和ABTS^2-，观察颜色变化；颜色变为绿色，表示待检样品为美洲大蠊；颜色没有发生变化，表示待检样品非美洲大蠊。

2.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(3)中所述PCR反应的体系为：10×PCR buffer5μl，每种脱氧核苷酸浓度为2.5mM的dNTP2μl，浓度为5U/μl的EX Taq酶0.5μl，20μM的LCO14901μl、20μM的HCO21981μl，基因组DNA3μl，ddH₂O补足至50μl；

步骤(3)中所述的PCR反应的条件为：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃30s，20个循环；72℃10min。

3.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的将PCR产物纯化通过如下步骤实现：将PCR产物进行凝胶电泳，切下含目的基因条带的凝胶，提取目的基因。

4.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(4)中所述可视化扩增的体系为10×PCR buffer5μl，每种脱氧核苷酸浓度为2.5mM的dNTP2μl，浓度为5U/μl的DNA Polymerase I酶0.5μl，20μM的LCO14901μl，20μM的探针I4μl，COI序列1μl，ddH₂O补足至50μl；

步骤(4)中所述可视化扩增的条件为94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃45s，30个循环。

5.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的空白沉默液为浓度为1.714M的NaCl溶液。

6.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的变性的条件为：95℃保温5min；

步骤(5)中所述的复性的条件为：变性后以1℃/min的速度降温至25℃保温30min；

步骤(5)中所述的反应的条件为25℃保温60min；

步骤(5)中所述的观察颜色变化的观察时间为2min。

7.根据权利要求1所述的可视化鉴定美洲大蠊的方法，其特征在于：步骤(5)中各成分的用量如下：每50μl可视化扩增产物加入0.012mol NaCl、0.108μmol hemin、0.126mmol H₂O₂和0.126mmol ABTS^2-。

8.一种实现上述可视化鉴定美洲大蠊的方法的试剂盒，其特征在于：包含探针I；探针I的序列如下：

5’-AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA-3’；

其中，方框框住部分为前缀序列；与划横线部分序列反向互补，起到沉默空白的作用；粗体字部分为G-四联结构。