[发明专利]一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系

权利要求书

1.一种培养人血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)利用干细胞扩增培养基扩增CD34⁺单个核细胞；

(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得人血管内皮祖细胞；

其中，所述的干细胞扩增培养基由干细胞基础培养基以及如下细胞因子组成：

干细胞因子：50-500ng/mL；

Flt3-配体：50-500ng/mL；

血小板因子：5-200ng/mL；

白介素3：5-250ng/mL；

粒细胞集落刺激生物因子：5-25ng/mL；和

Sall样蛋白4B：1-10ng/mL；

其中，所述的内皮祖细胞培养基由内皮细胞基础培养基以及如下组分组成：

血管内皮生长因子：10-100ng/mL；

胰岛素样生长因子：5-100ng/mL；

表皮细胞生长因子：2-20ng/mL；

成纤维细胞生长因子：5-100ng/mL；

抗坏血酸：0.5-5μg/mL；

肝素：50-200U/mL；

氢化可的松：80-300ng/mL；和

L谷胺酰胺：1-5mM。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内皮细胞基础培养基选自：EGM-2培养基、M199、M200培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：CD34⁺单个核细胞加入到所述的干细胞扩增培养基中，使得细胞浓度为5-40×10⁴个细胞/mL；培养2-4天后根据细胞数目增加量添加所述的干细胞扩增培养基使得细胞浓度为5-40×10⁴个细胞/mL；步骤(1)进行5-7天。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：步骤(1)进行5-7天后，将获得的细胞转移到所述的内皮祖细胞培养基中、置于包被有纤维连接蛋白的培养板中培养，细胞在培养基中密度为0.3-3×10⁶个细胞/mL，继续培养2-4天后吹散细胞，选择贴壁细胞继续培养；后续每3天更换1次内皮祖细胞培养基；更换3-6次后收获细胞。

5.一种用于制备人血管内皮祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(a)用于扩增CD34⁺单个核细胞的干细胞扩增培养基；和(b)用于培养人血管内皮祖细胞的培养基；

其中，所述的用于扩增CD34⁺单个核细胞的干细胞扩增培养基由干细胞基础培养基以及如下细胞因子组成：

干细胞因子：50-500ng/mL；

Flt3-配体：50-500ng/mL；

血小板因子：5-200ng/mL；

白介素3：5-250ng/mL；

粒细胞集落刺激生物因子：5-25ng/mL；和

Sall样蛋白4B：1-10ng/mL；

其中，所述的用于培养人血管内皮祖细胞的培养基由内皮细胞基础培养基以及如下组分组成：

血管内皮生长因子：10-100ng/mL；

胰岛素样生长因子：5-100ng/mL；

表皮细胞生长因子：2-20ng/mL；

成纤维细胞生长因子：5-100ng/mL；

抗坏血酸：0.5-5μg/mL；

肝素：50-200U/mL；

氢化可的松：80-300ng/mL；和

L谷胺酰胺：1-5mM。

6.如权利要求5所述的用于制备人血管内皮祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述的用于扩增CD34⁺单个核细胞的干细胞扩增培养基中细胞因子如下：

干细胞因子：100-300ng/mL；

Flt3-配体：100-300ng/mL；

血小板因子：10-60ng/mL；

白介素3：10-150ng/mL；

粒细胞集落刺激生物因子：8-20ng/mL；和

Sall样蛋白4B：2-8ng/mL。