[发明专利]一种聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域

背景技术

Cathelicidin家族是一类在哺乳动物、禽类、鱼类及爬行动物体内表达的保守的抗菌肽。LL-37是人体唯一合成的Cathelicidin家族抗菌肽，主要由免疫细胞和上皮细胞表达合成。LL-37的序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，因前两个均为LL(亮氨酸)且序列长度为37而得名。LL-37通过结构中形成的正6个正电荷的双亲超螺旋与细菌细胞膜磷脂的亲水部结合，然后其疏水部翻转插入磷脂双分子层，从而引起细胞膜的破坏。LL-37对革兰氏阳性和阴性菌均有效果，其抗菌谱广，受到研究与应用领域的广泛重视。

干扰素是由免疫细胞产生的一类糖蛋白，具有抗肿瘤、抗病毒和调节免疫的作用，在临床上获得广泛应用。干扰素在临床上使用存在的主要问题是由于其分子量小，容易被血清中的蛋白酶降解和被肾小球过滤掉。克服干扰素使用过程中缺陷的有效手段，一是通过融合表达，增加分子量；二是通过表面修饰，防止蛋白酶的降解。

发明内容

1PEG表观质量检测

PEG5000、PEG10000、PEG20000用硼酸-硼砂缓冲液(pH9.0)溶解成终浓度10mg/mL。进行SDS-PAGE分析，采用而磺染色，用凝胶成像系统拍照。

2PEG分子量对修饰产物的影响

配制蛋白浓度0.6mg/mL3份，按蛋白∶PEG(摩尔比)＝1∶10分别加入mPEG5000-SS、PEG10000-SS和PEG20000-SS，反应条件为4℃、6h，取样进行SDS-PAGE分析。

3融合蛋白浓度对产物修饰率的影响

按浓度梯度0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL，蛋白∶mPEG-SS(摩尔比)＝1∶10修饰反应液，反应条件为4℃、6h，取样分析融合蛋白修饰率。

4蛋白与mPEG-SS摩尔比对产物修饰率的影响

在上述确定的最佳蛋白浓度下，分别取蛋白∶mPEG-SS(摩尔比)＝1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25制备修饰反应液，反应条件为4℃、6h，取样分析融合蛋白修饰率。

5反应时间对产物修饰率的影响

在前述确定的蛋白浓度、蛋白PEG摩尔比、温度条件下，制备7份反应液，分别反应2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h，取样分析融合蛋白修饰率。

6反应温度对产物修饰率的影响

在前述确定的蛋白浓度与蛋白PEG摩尔比的条件下，制备4份修饰反应液，分别在4℃、10℃、20℃、30℃条件下反应6h，取样分析融合蛋白修饰率。

7pH对融合蛋白修饰率的影响

在前述确定的最优条件下，制备10份反应液，分别调节pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，取样分析融合蛋白修饰率。

8聚乙二醇修饰的人干扰素与人抗菌肽融合蛋白

8.1相对分子质量与修饰率的测定

通过凝胶电泳成像系统获得凝胶图谱，用系统软件进行扫描分析。根据蛋白Marker估计PEG及其修饰产物的相对分子质量，并按下式计算蛋白修饰率：

8.2修饰产物的体外活性检测

修饰产物的干扰素活性按《中国药典》三部(2010版)附录中干扰素将从测定方法检测其体外活性，并对照原料蛋白活性，计算活性保留率。

修饰产物的抗菌活性用大肠杆菌ATCC25922作为检测菌种，用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径3mm的圆孔，每孔加10μL发酵液，37℃孵化3h后，在底层上覆盖一层营养琼脂，37℃继续培养20h，测量无菌生长的透明圈直径。并对照原料蛋白活性，计算活性保留率。

8.3修饰产物半衰期的测定

从皮下给SD大鼠单剂量注射人IFN-α2a或经PEG修饰的人IFN-α2a与人LL-37融合蛋白，注射剂量分别为2.5μg/kg和5μg/kg。选取不同的时间点抽取SD大鼠的血液样品，肝素抗凝，离心后用人IFNαELISA试剂盒测定血浆中融合蛋白的量。

附图说明

图1PEG₅₀₀₀、PEG₁₀₀₀₀与PEG₂₀₀₀₀的SDS-PAGE图谱

图2PEG分子量对LL-37与IFN-α2a融合蛋白修饰的影响