[发明专利]马铃薯病毒检测引物及方法

权利要求书

1.一种马铃薯病毒检测引物，其特征在于：具体包括如下五个引物对：

马铃薯X病毒引物对：上游引物5'-CTGGCAAGCACAAGGTTT-3'，下游引物5'-TGGGCAGCATTCATTTCA-3'；

马铃薯M病毒引物对：上游引物

5'-GCCGACTGAGCACGTGCAGCAGGT-3'，下游引物5'-

GTCAGCATATGATTCCATGTCACCGG-3'；

马铃薯Y病毒引物对：上游引物5'-AGAGCAAGGCAGCATCCAGT-3'，下游引物5'-TGTTCATCCCCATCCATCAT-3'；

马铃薯A病毒引物对：上游引物5'-ATTTAGGTACTGCTGGGACT-3'，下游引物5'-TCAGGTTGCGTTGAAGAC-3'；

马铃薯S病毒引物对：上游引物5'-TGTAGAGGAGCATAGAGTTGG-3'，下游引物5'-CTTGTGGGCATTGTGAGC-3'。

2.根据权利要求1所述的马铃薯病毒检测引物，其特征在于：所述马铃薯X病毒引物对对马铃薯X病毒PCR扩增出138bp的产物；所述马铃薯M病毒引物对对马铃薯M病毒PCR扩增出213bp的产物；所述马铃薯Y病毒引物对对马铃薯Y病毒PCR扩增出369bp的产物；所述马铃薯A病毒引物对对马铃薯A病毒PCR扩增出468bp的产物；所述马铃薯S病毒引物对对马铃薯S病毒PCR扩增出657bp的产物。

3.一种马铃薯病毒检测方法，其特征在于：根据马铃薯X病毒、马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒及马铃薯S病毒五种病毒的外壳蛋白序列保守区域分别设计合成出如权利要求1中所述马铃薯X病毒引物对、马铃薯M病毒引物对、马铃薯Y病毒引物对、马铃薯A病毒引物对及马铃薯S病毒引物对；然后建立RT-PCR检测体系，并利用所述马铃薯X病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯X病毒、马铃薯M病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯A病毒、马铃薯S病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯S病毒进行RT-PCR反应，最后将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析和PCR产物克隆测序比对。

4.根据权利要求3所述的马铃薯病毒检测方法，其特征在于：所述RT-PCR反应的反应体系和反应程序如下：

反应体系：反应体系的总体积为25μL，含2.0μL模板、0.15μL5U·μL^-1的Ex Taq酶，2.0μL2.5mmol·L^-1的dNTP，2.5μL的10×PCR buffer、0.30μL10μmol·L^-1的马铃薯X病毒上游引物、0.30μL10μmol·L^-1的马铃薯X病毒下游引物、0.05μL10μmol·L^-1的马铃薯M病毒上游引物、0.05μL10μmol·L^-1的马铃薯M病毒下游引物、0.30μL10μmol·L^-1的马铃薯Y病毒上游引物、0.30μL10μmol·L^-1的马铃薯Y病毒下游引物、0.15μL10μmol·L^-1的马铃薯A病毒上游引物、0.15μL10μmol·L^-1的马铃薯A病毒下游引物、0.2μL10μmol·L^-1的马铃薯S病毒上游引物、0.2μL10μmol·L^-1的马铃薯S病毒下游引物、其余成分为ddH₂O；

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸l0min，4℃保存。