[发明专利]一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鹿骨膜条件培养液的制备方法及应用，属于细胞组织培养技术领域。

背景技术

鹿茸是目前所知的唯一能够完全再生的复杂哺乳动物器官，其再生包括软骨、骨、皮肤、血管和神经的再生。其中对神经再生的研究发现：鹿茸神经的再生和快速生长主要由角柄骨膜来源的生物分子的刺激实现的。而要想分析这些角柄骨膜来源的生物分子，必须建立一个离体的培养体系。

在细胞培养过程中，细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞或组织以后，含有细胞或组织分泌物的培养液就叫做条件培养液。目前对细胞条件培养液的研究较多。由于组织培养的复杂性，对组织条件培养液的制备体系很少，尤其是骨膜组织条件培养液的制备技术尚未见报导。

但细胞条件培养液只能反映离体条件下，单个细胞分泌活性物质的情况，而活体条件下，细胞的任何活动都离不开细胞间质，所以单纯的细胞条件培养液并不能反映组织中细胞与其间质相互作用的情况下，分泌活性物质的情况。现有技术中组织条件培养液的制备方法多是利用三角瓶，再向三角瓶中充满二氧化碳气体进行密封培养。这种培养不能为组织提供立体的培养环境，而且培养过程中二氧化碳浓度很难控制，培养过程中不能随时收集条件培养液。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种鹿骨膜条件培养液的制备方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种鹿骨膜条件培养液的制备方法，该方法是将鹿骨膜组织切片后置于插入皿中，向插入皿中加入培养基培养，培养后收集培养液，过滤后获得条件培养液；

所述插入皿底部由孔径为0.4μm的涤纶树脂材料制成，培养时插入皿放入多孔培养板中，这样就将培养空间分成了上室和下室，且上室和下室之间有培养液的沟通

所述制备方法的步骤如下：

1)利用动物组织切割器将活体采集的鹿骨膜组织切割成薄片，获得骨膜组织切片；

2)将步骤1)所得的骨膜组织切片放入包被好的插入皿中，再将插入皿放到多孔培养板的孔中；

3)向插入皿和培养板中加入液体培养基培养，培养完成后收集培养液；

4)用滤膜过滤步骤3)所得培养液，获得条件培养液。

步骤1)所述骨膜组织切片，长2-6mm，宽1.5-2mm，厚0.2-1.7mm。

步骤2)所述骨膜组织放入包被好的插入皿，是将10-100片骨膜组织切片放入到用鼠尾胶原或I型胶原包被的插入皿中；所述插入皿将培养空间分为上室和下室，上室和下室通过0.4μm孔径的涤纶树脂膜联通；所述多孔培养板，培养孔的数量可以为24，12，或6个。

步骤3)所述液体培养液为神经培养液，具体组成为：neurobasal medium(Gibco)加入2％B27supplement(Life Technologies)再加入1％抗生素(Gibco)。

步骤3)所述培养，培养温度为37℃，CO₂浓度为5％，湿度为饱和湿度，培养时间为2-4d。

步骤4)所述滤膜过滤，是利用0.22μm的滤膜进行过滤。

所述方法的具体步骤如下：

1)利用动物组织切割器将活体采集的鹿骨膜组织切割成长2-6mm，宽1.5-2mm，厚0.2-1.7mm的薄片，获得骨膜组织切片；

2)将10-100片步骤1)所得的骨膜组织切片，放入用鼠尾胶原包被的插入皿中，再将插入皿放到多孔培养板的孔中；

3)向插入皿和培养板中加入神经培养液，于37℃，CO₂浓度为5％，湿度为饱和湿度的条件下培养2-4d，培养完成后收集培养液；

4)利用0.22μm的滤膜过滤步骤3)所得培养液，获得鹿茸骨膜组织条件培养液。

所述方法用于制备鹿茸骨膜组织条件培养液。

本发明所取得的有益效果如下：

1)本发明所提供的方法能够使鹿骨膜组织在离体培养条件下分泌活性物质，进而收集、分析所分泌的活性物质，解决了活体条件下很难分离、分析某些组织所分泌的含量极少的，分子很小的而又起到很关键作用的活性物质的难题。

2)本发明所提供的方法能够有效提高培养组织的成活率，并缩短组织的培养时间。

3)本发明所提供的方法可以实现随时收集条件培养液和更换新鲜培养液，操作十分方便。

附图说明

图1为本发明所用动物组织切割器；

(A为切割台；B.为切割器，由20个左右的刀片平行放置，每两个刀片中间用0.7mm厚的隔板间隔开；C为装卸扳手)。