[发明专利]可评价脂肪基质细胞成骨向分化的萤光素酶报告系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种成骨向分化检测技术，尤其涉及一种可评价脂肪基质细胞成骨向分化的萤光素酶报告系统。

背景技术

自从提出组织工程的概念以来，组织工程尤其是骨组织工程获得了飞速发展,目前被认为是最快能获实际应用的领域。十余年来大量工作围绕骨组织工程三要素(细胞,支架材料,生长因子)开展。而几乎所有的研究,都会用到成骨的检测与评价。

现有技术中，比较常用的成骨向分化检测方法包括碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色等方法检测钙的含量以及反转录-实时定量PCR检测骨形成的分化标记物等(如Ⅰ型胶原、骨钙蛋白和骨桥蛋白等)。

碱性磷酸酶能通过水解磷脂释放出无机磷，增加局部钙、磷的浓度，并在胶原原纤维中沉积，从而促进基质钙化。碱性磷酸酶检测是骨组织工程使用最多的检测骨形成和骨间质矿化的手段，碱性磷酸酶活性的高低是反映成骨细胞成熟状态的一个重要指标，然而该方法的特异性较低，因此使其应用受到了一定的限制；茜素红能与钙离子以螯合方式形成复合物，用来识别组织细胞的钙盐成分。通过茜素红染色，产生桔红色沉积(即钙结节)，但会受到其他金属离子的干扰；反转录实时定量PCR虽然在检测成骨分化时具备特异性高、敏感性高等特点，但是其操作需经历RNA提取反转录等繁琐步骤，另外受制于荧光定量试剂的高成本，使其在处理较大样本量情况下力不从心。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快捷、特异且定量的检测出细胞在体外的成骨向分化情况的可评价有成骨向分化潜能细胞成骨向分化的萤光素酶报告系统。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的可评价有成骨向分化潜能细胞成骨向分化的萤光素酶报告系统，将成骨相关的启动子克隆到萤光素酶报告基因的上游，当有成骨向分化潜能细胞向成骨细胞分化时，成骨相关的启动子转录活性增强，能激活萤光素酶表达。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的可评价有成骨向分化潜能细胞成骨向分化的萤光素酶报告系统，由于将成骨相关的启动子克隆到萤光素酶报告基因的上游，当有成骨向分化潜能细胞向成骨细胞分化时，成骨相关的启动子转录活性增强，能激活萤光素酶表达，能够快捷、特异且定量的检测出细胞在体外的成骨向分化情况，并且使将来能够活体监测小动物外源移植细胞的成骨分化成为可能。

附图说明

图1为本发明实施例提供的可评价有成骨向分化潜能细胞成骨向分化的萤光素酶报告系统的构建及检测流程示意图；

图2为本发明实施例中将小鼠骨钙素的启动子克隆到萤光素酶报告基因的上游的构建过程示意图；

图3为本发明实施例中茜素红矿化结节染色实验结果示意图；

图4为本发明实施例中荧光素酶报告基因分析结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。

本发明的可评价有成骨向分化潜能细胞成骨向分化的萤光素酶报告系统，其较佳的具体实施方式是：

将成骨相关的启动子克隆到萤光素酶报告基因的上游，当有成骨向分化潜能细胞向成骨细胞分化时，成骨相关的启动子转录活性增强，能激活萤光素酶表达。

所述成骨相关的启动子包括小鼠骨钙素的启动子。

将所述成骨相关的启动子克隆到萤光素酶报告基因的上游后，进行慢病毒的包装并筛选出阳性克隆后，感染需评价的有成骨向分化潜能细胞。

所述有成骨向分化潜能细胞包括脂肪基质细胞。

骨钙素Osteocalsin(OC)是成骨标志物的一种，本发明将小鼠骨钙素(Osteocalsin,OC)的启动子克隆到萤光素酶Luciferase报告基因的上游，筛选出阳性克隆，进行慢病毒的包装后感染有成骨向分化潜能细胞(如人脂肪基质细胞)，成功构建出了可用于评价成骨向分化的萤光素酶报告系统，该方法能够快捷、特异且定量的检测出细胞在体外的成骨向分化情况，并且使将来能够活体监测小动物外源移植细胞的成骨分化成为可能。

当细胞向成骨细胞分化时,OC的启动子转录活性增强，从而激活萤光素酶表达。为了验证该系统的有效性，在hASCs成骨诱导的第7、14天，同时进行了荧光素酶报告基因的检测和茜素红钙化结节染色实验，结果荧光素酶表达的趋势与茜素红染色一致，验证了该系统的良好效能。

具体实施例，如图1所示：

1.构建pLVX-OC_pro-Luc-Puro载体：