[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的卡他莫拉菌快速检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis，Mc)抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。

背景技术

卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis，Mc)首次发现于1896年，当时称之为卡他微球菌(Micrococcuscatarrhalis)，尔后又称为卡他奈瑟菌(Neisseriacatarrhalis)和卡他布兰汉菌(Branhamellacatarrhalis)。卡他莫拉菌为革兰氏阴性球菌,通常呈肾形双球菌状，偶可呈四联状，无鞭毛，无芽胞，一般无荚膜。其营养要求不高，普通培养基上即可生长，需氧，最适生长温度为35℃。菌落直径1～3mm，光滑型，灰白色，不透明，整个菌落易从培养基上刮下。较长时间培养后，菌落可呈粗糙颗粒状，黏附在培养基表面。产氧化酶和DNA酶。对糖类均不发酵。抵抗力较强，在痰中可存活27d，65℃时可存活30min。

过去一直认为Mc是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌，但是，近20多年的研究发现，该菌不仅可以引起儿童和老年人的上呼吸道感染，而且还是引起成人下呼吸道感染的重要病原菌，是儿童上颌窦炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常见致病菌，仅次于肺炎支原体和肺炎链球菌。已有报道该菌可引起呼吸道医院感染爆发流行。因此，卡他莫拉菌及其所致感染日益受到人们关注，对该菌的生物学特性、流行病学、所致疾病、耐药性以及感染的防治有了更多的认识。

临床上由于Mc与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、x-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。而儿童疾病的特点是起病急、转归快，因此敏感、快速、实用的Mc检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。

尽管Mc在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，Mc感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。

检测血清中McIgG、IgA、IgM抗体常用的方法有：微量免疫荧光抗体检测(MIF)，补体结合试验(CF)，重组酶免疫测定(rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验(SeroCF—EIA)等。然而Mc抗体的检出只能说明该个体感染过Mc，却不能反映体内是否仍有Mc活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的时间。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。

核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交检测Mc的特异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。

病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于血平板，35～37℃，于含5％二氧化碳(CO₂)孵箱中孵育16～20h，再根据菌落形态、革兰染色及生化鉴定(氧化酶阳性、葡萄糖阴性，DNA酶、硝酸盐还原酶阳性)确定为卡他莫拉菌。该法为检测卡他莫拉菌感染的“金标准”，但其存在操作步骤复杂，检测时间长等明显缺陷，并不十分适合临床应用。

因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的卡他莫拉菌抗原快速检测法以满足临床的检测需求就显得非常必要了。

发明内容

针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的能简便、快速、高灵敏度的检测卡他莫拉菌抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于磁性分离和量子点标记的检测卡他莫拉菌抗原的方法，其特征在于：所述该方法包括以下步骤：

1)兔抗卡他莫拉菌UspA1蛋白多克隆抗体的制备；

2)鼠抗卡他莫拉菌UspA1蛋白多克隆抗体的制备；

3)将步骤1)制备得到的兔抗卡他莫拉菌UspA1蛋白多克隆抗体与纳米磁珠通过共价偶联，制备抗卡他莫拉菌免疫纳米磁珠；

4)将步骤2)制备得到的鼠抗卡他莫拉菌UspA1蛋白多克隆抗体与纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针；