[发明专利]用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用。

背景技术

禾谷孢囊线虫又称燕麦孢囊线虫、禾谷孢囊线虫，对小麦、大麦、黑麦、燕麦及多种禾本科牧草具有严重危害性，是世界上广泛存在的病原线虫，尤其对小麦的生产构成严重的威胁。我国自1987年在湖北天门县发现该病害以来，迄今已在华北、西北、华中以及华东等13个省区市发现有分布，且有逐渐蔓延之势。目前的主要防治方法包括农业防治、化学农药防治和生物防治。长期以来我国农民主要采取轮作、灌溉、增施有机厩肥、深翻和日晒土壤、种植诱捕植物和调节播期等农业技术措施防治线虫,但是日常种植的作物基本上都是禾谷孢囊线虫的寄主,因而防治效果并不显著。化学农药防控线虫是有效的方法之一，但是它对环境和农产品造成的污染使得该方法缺陷凸显。而生物防治目前报道最多的是食线虫真菌和线虫天敌细菌,但因其效果不明显,商品化困难,至今尚没有一种生防制剂被广泛推广。因此,寻找安全而又行之有效的线虫防治途径非常必要。

RNAi干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA降解,使相应基因的表达关闭,从而引发的转录或转录后水平的基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。这种现象是生物为保护自身基因组免受外源(如病毒)和内源性(如转座元件)序列的侵袭,特异性地调节或干扰基因表达的一种自身防御“免疫”应答现象。

关于线虫研究中,已发现线虫体内存在着能把RNAi信号放大和传递的机制，微量的dsRNA就能引导机体产生强烈的RNAi效应,而且能够传递到子代。dsRNA可以通过微注射进入C.elegans成虫,也可以把C.elegans成虫浸泡在含有dsRNA的溶液中或者喂饲含有dsRNA的大肠杆菌。注射进入的dsRNA很容易在干细胞中扩散引起RNAi,而且能将这种效应传递到子代。这种方法产生的表型外显率高,非常适合胚胎基因的功能研究。然而注射法需要体外合成dsRNA和手工注射操作,费时、花费高而且技术难度大,很难用于大规模的功能分析。浸泡法是将线虫浸泡于高浓度的dsRNA溶液。相比注射法,浸泡法能够同时对大量的线虫材料进行处理。但是,浸泡法同样需要体外合成大量的dsRNA(一般为1-5mg/ml),成本很高。与注射法和浸泡法比较，喂饲法有其独特的优势。喂饲法通过构建特殊载体,细菌体内诱导表达dsRNA,再喂饲线虫,可以有效抑制靶标基因的表达，省钱省事,并且可大规模进行实验。因而,如果建立一个RNAi细菌喂饲文库,该方法就可高效地研究大批基因的功能，从而找出可用于农业生产中线虫的防治方法。