[发明专利]miRNA捕获探针及其修饰电极与捕获探针互补链及其修饰碳纳米管‑金磁纳米粒复合物

说明书

技术领域

本发明属于生物、材料和电化学检测技术领域，涉及一种捕获探针及其修饰电极，与捕获探针互补链及其修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，还涉及用上述修饰电极和修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物检测生物活性小分子的方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一类长度为21～25个核苷酸的内源性非编码RNA，能够与靶基因3′非翻译区结合在转录后水平负调控基因的表达。miRNA与人类疾病的发生、发展密切相关，且血液、尿液中的miRNA稳定性强、重复性好，因此可作为多种疾病尤其是肿瘤诊断的非创伤性生物标志物。

目前用于miRNA检测的方法主要有Northern印迹、基因芯片和实时定量PCR(qRT-PCR)等。Northern印迹是首先被用于半定量检测miRNA的实验技术，至今仍被视为是检测miRNA的金标准，由于其存在要求的样本量大、灵敏度低、操作耗时且不适用于高通量检测等缺点，通常用于miRNA检测结果的验证。基因芯片技术是当前广泛用于检测miRNA水平的高通量技术，该技术可一次性对大量样本进行持续、快速、有效的检测，但同样存在检测所需样本量较大、耗费较高、不同实验室之间结果可重复性差等诸多不足，一般多用于miRNA的初筛。qRT-PCR是生物医学领域中较常用的miRNA检测方法，系通过反应体系中荧光强度的变化对目标miRNA片段的扩增进行实时检测，具有敏感性高、准确度高、方法简单等优点，但对引物设计及实验操作要求较高。因此，急需建立一种操作简便、具有较高特异性和敏感性的检测miRNA的新方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miRNA捕获探针及其修饰电极，与miRNA捕获探针互补链及其修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，并基于上述修饰电极和修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物建立一种检测miRNA的新方法，可以实现对miRNA的快速、灵敏、特异和稳定检测。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.miRNA捕获探针，为单链DNA，从5’端至3’端依次含有与miRNA部分互补片段、核酸内切酶酶切位点以及与辅助探针部分互补片段，其3’末端还修饰有巯基；所述辅助探针为单链DNA，从5’端至3’端依次含有与捕获探针部分互补片段以及与miRNA部分互补片段；所述miRNA捕获探针中含有的与miRNA部分互补片段和所述辅助探针中含有的与miRNA部分互补片段不重叠。

进一步，所述miRNA捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述辅助探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

更进一步，所述miRNA捕获探针为5′-CCACTTCAGTTAT-CCTCAGCGTGGAAAA-(CH₂)₆-SH-3′；所述辅助探针为5′-CCACGCTGAGGAAATCACAGTACTGTA-3′；

2.miRNA捕获探针修饰电极，由以下方法制得：将经打磨、抛光、洗涤、干燥处理的金电极表面用miRNA捕获探针修饰后，再用己烷巯醇封闭非特异性吸附位点，即得miRNA捕获探针修饰电极。

进一步，所述miRNA捕获探针修饰电极由以下方法制得：用润湿的麂皮打磨金电极，然后依次用加有0.3μm和0.05μm Al₂O₃粉末的麂皮对电极进行抛光打磨，每次打磨后将电极用水洗净，再依次用乙醇和水超声洗涤，处理后的金电极干燥备用；然后在处理后的金电极表面滴加2μM的miRNA捕获探针溶液，修饰过夜，用水清洗电极，再在电极表面滴加1mM的己烷巯醇溶液，孵育40分钟封闭非特异性吸附位点，用水清洗电极，即得miRNA捕获探针修饰电极。

3.miRNA捕获探针互补链，所述互补链与miRNA捕获探针中核酸内切酶剪切点下游序列互补，其3’末端还修饰有氨基。

进一步，所述miRNA捕获探针互补链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

更进一步，所述miRNA捕获探针互补链为5′-TTTTCCACGCTGA-(CH₂)₆-NH₂-3′。