[发明专利]argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用

说明书

背景技术

L-瓜氨酸（Citrulline）是一种重要的非蛋白质α-氨基酸，由于是在1914年第一次从西瓜中提取分离出来，所以命名为瓜氨酸。是参与人体尿素循环（urea cycle）的重要中间代谢物，对于人类和哺乳类动物解除氨毒有重要作用。L-瓜氨酸还参与一个极为重要的信使分子—NO的生成，同时在医药方面，瓜氨酸可作为异体排斥效应的指示剂、治疗肝脏昏迷和应用于诊断类风湿关节炎，在生化方面瓜氨酸也有重要的应用，可以作为一种高效抗氧化剂，保护DNA和酶免受自由基氧化。 

L-瓜氨酸的生产方法目前主要有化学合成法、提取法、酶法和发酵法。相比化学法产物不纯、污染环境，提取法得率低、成本高，酶法活性不高、转化率低等问题，微生物发酵法作为最具优势的氨基酸生产方式被广泛应用，因为发酵法生产瓜氨酸成本低廉，产品纯度好，安全性高。目前生物法合成瓜氨酸的主要菌种包括：Bacillus subtilis、Arthrobacter paraffineus、E scherichia、Corynebacteria glutamicum等。其中谷氨酸棒杆菌Corynebacteria glutamicum在氨基酸发酵产业广泛应用，用于生产多种氨基酸，如谷氨酸、精氨酸、赖氨酸等。谷氨酸棒杆菌具有生长迅速、易培养、耐受性强、发酵条件成熟等特点，成为最具潜力的瓜氨酸生产菌种。 

随着谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ATCC 13032全基因组测序的完成及相关氨基酸代谢途径的基因和关键酶的深入研究（瓜氨酸代谢途径如图1所示），给通过代谢工程和基因工程定向改变相关基因提供了大量的信息和技术支持，进而优化代谢途径，提高所需的目的氨基酸产量。 

在谷氨酸棒杆菌中，L-瓜氨酸的合成以L-谷氨酸为底物，经5种酶的催化而生成。微生物中根据乙酰基团参与方式的不同，L-瓜氨酸的代谢途径可以分为两种模式：线性途径和循环途径。谷氨酸棒杆菌中采用循环途径，即N-乙酰鸟氨酸在由argJ基因编码的N-鸟氨酸乙酰转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时，乙酰基团被转移到谷氨酸形成N-乙酰谷氨酸，这种乙酰基团的循环利用称为经济循环途径。代谢途径上的相关酶有的会受到中间产物或终产物的反馈抑制，通过基因工程的手段，可解除这种反馈抑制，进而提高酶活和产物的生成量。 

发明内容

   本发明提供argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，本发明在研究过程中发现，在代谢过程中，argJ基因表达的N-鸟氨酸乙酰转移酶受到目的产物瓜氨酸的抑制，因此通过基因工程手段过表达argJ基因，提高N-鸟氨酸乙酰转移酶活性，进而降低瓜氨酸对此酶的抑制作用，从而提高瓜氨酸的合成能力。 

本发明采用的技术方案为： 

argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用。

所述argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，本发明首次发现瓜氨酸对N-鸟氨酸乙酰转移酶活性有抑制作用，30 mM瓜氨酸能够降低谷氨酸棒杆菌N-鸟氨酸乙酰转移酶酶活50%。将argJ基因通过基因工程手段导入到微生物中进行过表达，提高N-鸟氨酸乙酰转移酶活性，从而提高L-瓜氨酸产量。 

所述argJ基因是来自谷氨酸棒杆菌C. glutamicum ATCC 13032的argJ基因，基因序列如SEQ.No.1。 

所述argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，包括如下步骤： 

1）构建含有argJ基因的重组表达质粒；

2）将步骤1）构建的质粒电转到微生物中，筛选阳性转化子；

3）将步骤2）筛选得到的阳性转化子进行发酵生产L-瓜氨酸。所述微生物优选为谷氨酸棒杆菌、钝齿棒杆菌或者北京棒杆菌中的一种。

所述argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，详细操作步骤如下： 

1) 构建含有argJ基因的重组表达质粒pXMJ19-argJ（cg）：

以谷氨酸棒杆菌DNA为模板，利用PCR方法扩增出argJ基因（N-鸟氨酸乙酰转移酶基因），引物为