[发明专利]一种人腺病毒快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种人腺病毒快速检测试剂盒，具体涉及一种用于提取人腺病毒DNA的提取液、检测人腺病毒的PCR反应液、用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列、人腺病毒快速检测试剂盒及定量检测人腺病毒数量的方法。

背景技术

腺病毒是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。

人体腺病毒已知有52种，分别命名为adl～ad52，研究得最详细是ad2。腺病毒基因组转录产生mRNA，已知的转录单位至少有5个：EⅠ区位于病毒基因组左侧，可再分成EⅠA和EⅠB，与细胞转化有关；EⅡ区编码DNA结合蛋白，参与病毒的复制；EⅢ区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；EⅣ区位于ad2基因组右端，受EⅡ区编码的DNA结合蛋白质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成ad2蛋白质Ⅳ。

腺病毒对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞。使细胞转化只需要腺病毒基因组的一部分，这些基因位于基因组的左端，约占整个基因组的7％～10％。人体细胞是一类允许细胞(permissive cell)，即这类细胞允许感染入侵的病毒在细胞内复制增殖，最后细胞裂解死亡而释放出大量子代病毒。在体外培养的多种人体肿瘤细胞中均未查出腺病毒颗粒，但在人的1号染色体上有adl2的整合位点，这意味着人体细胞对于腺病毒也可能是非允许细胞，即这类细胞在病毒感染后，病毒不能在细胞内复制增殖，但可整合在受感染细胞的基因组内。这些细胞被病毒转化，表型发生改变，且可在体外无限期地培养传代。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。因此快速及时的检测出病因对于正确治疗以及防止病情恶化有着极为重要的作用。

病毒常用的检测方法是分离培养和病毒鉴定。从感染部位采集标本。加抗生素处理过夜，离心取上清接种敏感细胞(293、Hep-2或HeLa细胞等)，37℃孵育后可观察到典型CPE，即细胞变圆、团聚、有拉丝现象，最突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄串状。用荧光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，也常用血凝抑制试验或中和试验检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型。腺病毒可用Shell vial技术进行快速鉴定。病毒标本经抗生素和离心处理，取上清接种于有细胞的Shell vial培养瓶，孵育1～2天，用特异性六邻体单克隆抗体对其抗原表位进行检测。也可用病人鼻粘膜上皮脱落细胞直接染色检测病毒抗原。

抗原抗体结合的免疫学检测常用来直接检测腺病毒在呼吸道和胃肠道的感染,较快速且灵敏度较高。免疫荧光(尤其对呼吸道标本、咽拭子和活组织标本)和酶免疫分析(尤其对于粪便标本)是常用的方法,与细胞培养相比,免疫荧光所测腺病毒的灵敏性能提高40％～60％,其它直接测定抗原的方法包括免疫层析法和乳胶凝集法。但由于方法局限，免疫检测通量和灵敏就都受到限制。

聚合酶链式反应(PCR)技术在医学检测上的应用优势逐渐显现出来，PCR检测有检测灵敏度高，耗时短，重复性高，结果准确等特点，实时定量PCR是在普通PCR基础上发展出来的对PCR扩增结果实时记录检测的一种先进PCR反应体系。与传统PCR相比，实时定量PCR有更特异，结果更准确等优点。同时实时定量PCR也避免了PCR反应后的样品处理步骤，减少了检测之间的污染。

实时荧光定量PCR技术是目前腺病毒DNA的检测新方法，主要基于定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法具有检测灵敏度高、简单方便且对试验环境要求低的优点，已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒。但是，目前并没有报道一种在低反应量状态下即能快速准确检测人腺病毒的实时荧光定量PCR技术。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中人腺病毒检测时间长，灵敏度不高，不能定量检测的问题。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1、本发明提供一种用于提取人腺病毒DNA的提取液，该提取液包括pH 8.0的50mM Tris-HCl，pH 8.0的100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K。