[发明专利]来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用有效
| 申请号： | 201410409072.1 | 申请日： | 2014-08-19 |
| 公开（公告）号： | CN104293744B | 公开（公告）日： | 2017-04-12 |
| 发明（设计）人： | 郑裕国;郑仁朝;黎小军;吴欣玮;沈寅初 | 申请（专利权）人： | 浙江工业大学 |
| 主分类号： | C12N9/20 | 分类号： | C12N9/20;C12P13/00;C12R1/19 |
| 代理公司： | 杭州天正专利事务所有限公司33201 | 代理人： | 黄美娟,李世玉 |
| 地址： | 310014 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 来源于 嗜热踝节菌 脂肪酶 突变体 应用 | ||
1.一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，其特征在于所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。
2.如权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。
3.一种权利要求1或2所述来源于嗜热踝节菌ATCC 20186的脂肪酶突变体在制备普瑞巴林关键手性中间体中应用，其特征在于所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为螯合剂，以水或缓冲液为反应介质构成pH值为6.0～8.0的转化体系，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后，取反应液分离纯化，获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为0.1～3.0mol/L反应体系，所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为10～50g/L反应体系，Ca(OAc)2终浓度为50～180mmol/L反应体系。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含脂肪酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，再以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，28℃诱导培养10h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液减压蒸馏至原1/3体积，将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲苯进行萃取，取萃取层减压蒸馏至干，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
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