[发明专利]梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于设有外包装盒、浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶、包被有重组抗原微孔板；

浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶和包被有重组抗原微孔板装在外包装盒内；

浓缩洗涤液瓶内装有浓缩洗涤液，阴性对照品瓶内装有阴性对照品，阳性对照品瓶内装有阳性对照品，生物素标记重组抗原瓶内装有生物素标记重组抗原，辣根过氧化物酶标记亲和素瓶内装有辣根过氧化物酶标记亲和素，TMB显色液A瓶内装有TMB显色液A，显色液B瓶内装有显色液B，反应终止液瓶内装有反应终止液；

所述TMB显色液A为3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液；

所述显色液B为3％的过氧化氢溶液。

2.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液采用溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.05％，使用时用蒸馏水进行20倍稀释。

3.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述阴性对照品为梅毒螺旋体总抗体阴性对照品，由非梅毒感染的健康人群血清配制而成。

4.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为梅毒螺旋体总抗体阳性对照品，由梅毒患者的阳性血清配制而成。

5.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述反应终止液为摩尔浓度2mmol/L的硫酸。

6.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取梅毒螺旋体Nichol株和Reiter株外膜蛋白进行双向电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用梅毒血清进行免疫印迹实验，获得特征性的免疫印迹斑点，取对应的蛋白点进行质谱分析，分别找出Nichol株和Reiter株具有较高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；在梅毒螺旋体的全基因组序列中找出对应基因，设计引物并构建相应的表达载体，根据不同诱导条件对重组目标蛋白在大肠杆菌中表达量的影响，获得最佳诱导条件，大量扩增目标蛋白，收集过表达的目标蛋白进行纯化；将候选抗原通过免疫大鼠获得其相应多克隆抗体，采用酶联免疫方法测定抗体滴度，并使用免疫印迹方法验证这些重组抗原的免疫原性；采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得到梅毒螺旋体重组抗原；

2)将步骤1)得到的梅毒螺旋体重组抗原与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得到生物素标记重组抗原；

3)将步骤1)得到的梅毒螺旋体重组抗原用包被缓冲液稀释至20μg/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，风干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒、密封，得包被有重组抗原微孔板；

4)采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，得辣根过氧化物酶标记亲和素；

5)TMB显色液A采用市售品；

6)显色液B采用市售品；

7)配制溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.05％，得浓缩洗涤液；

8)配制摩尔浓度为2mmol/L的硫酸作为反应终止液；

9)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋体总抗体阴性对照品；

10)由梅毒患者的阳性血清配制梅毒螺旋体总抗体阳性对照品；

11)将生物素标记重组抗原、辣根过氧化物酶标记亲和素、TMB显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、反应终止液、阴性对照品、阳性对照品分别装在瓶中，再将生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、浓缩洗涤液瓶、反应终止液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶以及包被有重组抗原微孔板装入外包装盒中，得到梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒。