[发明专利]生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法

权利要求书

1.一种重组质粒pHGB1-TEV，其特征在于，所述质粒由原始质粒pET-22b (+)和His₆-GB1-TEV  DNA编码序列组成。

2.一种重组质粒pHGB1-TEV-LL-37，其特征在于，所述质粒由权利要求1所述的重组质粒pHGB1-TEV和LL-37基因的核苷酸序列组成，用于抗菌肽LL-37的表达。

3.一种重组质粒pHGB1-TEV-hEGF，其特征在于，所述质粒由权利要求1所述的重组质粒pHGB1-TEV和hEGF基因的核苷酸序列组成，用于hEGF的表达。

4.一种重组质粒pHGB1-TEV-mEGF，其特征在于，所述质粒由权利要求1所述的重组质粒pHGB1-TEV和mEGF基因的核苷酸序列组成，用于mEGF的表达。

5.一种包括如权利要求2所述的重组质粒的重组工程菌。

6.一种包括如权利要求3所述的重组质粒的重组工程菌。

7.一种包括如权利要求4所述的重组质粒的重组工程菌。

8.生物活性肽在原核细胞中的纯化方法，其特征在于，在纯化过程中，加入了带有His₆标签的TEV酶，所述纯化方法具体操作如下：

挑取如权利要求5或权利要求6或权利要求7所述的重组工程菌株于LB液体培养基中，

振荡过夜培养；将过夜培养物转接到新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养约3-4小时，待OD₆₀₀值0.6时加入IPTG至终浓度0.2 mM，22℃诱导过夜离心收菌，弃上清倒置使残余培养基流尽；用破菌缓冲液重悬沉淀，离心收菌，弃上清；取破菌缓冲液加入到沉淀中并吹打均匀，1：200加入苯甲基磺酰氟，超声波破菌至半透明；细菌破碎液离心，取上清；上Ni-NTA柱纯化，样品缓慢滴下使蛋白更好地与柱子结合；上样完毕后，先用破菌缓冲液洗柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，15％SDS-PAGE检测蛋白洗脱情况；Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用快速蛋白液相色谱FPLC进一步纯化；纯化的融合蛋白，加入带有His₆标签的TEV酶混匀4 °C过夜酶切，酶切产物再缓慢流过Ni-NTA柱，收集流出的蛋白溶液即为切下的没有His₆ 标签的LL-37或mEGF或hEGF。