[发明专利]一种曲马多人工抗原的制备方法

权利要求书

1.一种曲马多人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备人工半抗原：

(a)将盐酸曲马多溶于纯化水，滴加25%氢氧化钠，游离使之pH≈10；加入5-溴戊酸乙酯330ul，在80~90℃的油浴中反应3小时；展开剂：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4-二氧六环=8:1:10:1（v/v），Rf=0.6-0.7；

(b)反应结束后，用1N盐酸调pH=5.5，减压蒸干，得油状产物Ⅰ；

(c)产物Ⅰ用薄层色谱分析（TLC）法分离，展开剂：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4-二氧六环=8:1:10:1（v/v），Rf=0.6-0.7；收集所需部分硅胶，用无水乙醇提取，减压蒸干，得无色油状产物Ⅱ；

(d)产物Ⅱ按比例加入纯化水后，用DAS调pH=9，减压蒸干；按比例加入N,N-二甲基甲酰胺，过滤，滤液蒸干，得曲马多半抗原；反应比例：产物Ⅱ：纯化水：N,N-二甲基甲酰胺：=100mg：10ml：10ml；

(2)制备曲马多人工抗原：

(e)将曲马多半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺，反应比例：曲马多半抗原：N,N-二甲基甲酰胺：N-羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二亚胺=20mg：1ml：10mg：17mg，室温搅拌反应18小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；

(f)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；

(g)将BGG蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；

(h)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2-8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；

(i)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：曲马多-牛丙种球蛋白。